SHASHIN KAGAKU自動菌落計數儀在大腸菌群平板計數法中的應用

方案摘要：本方案基于大腸菌群平板計數法，結合 Pipetty 電動移液器與SHASHIN KAGAKU自動菌落計數儀核心優勢優化檢測流程。樣品稀釋與接種階段，Pipetty 憑借精準定量、防交叉污染及高效移液特性，確保接種量一致性，縮短樣品處理時間，保障稀釋梯度準確性。培養后，自動菌落計數儀通過預設顏色、直徑閾值，快速批量掃描 VRBA 平板，自動篩選 15~150CFU 有效平板，精準區分典型與可疑菌落，避免人工主觀誤差，實現數據自動記錄與追溯。提升檢測效率、精準度與標準化水平，高效完成大腸菌群定量分析，為樣品衛生狀況評估提供可靠支撐。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      以 VRBA 培養基為核心，通過膽鹽和結晶紫抑制革蘭氏陽性雜菌，利用大腸菌群發酵乳糖產酸使中性紅指示劑變色，形成紅色至紫紅色特征菌落實現選擇性分離。樣品經梯度稀釋后接種，在適宜溫度下培養，挑取特征菌落接種 BGLB 肉湯，通過發酵產氣確認陽性菌株，排除假陽性。最終選取 15~150 CFU 的有效平板，結合稀釋倍數和接種體積計算樣品中大腸菌群數量，評估樣品衛生狀況。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下：
① SHASHIN KAGAKU自動菌落計數儀;
② Pipetty 電動移液器MSIC01-03-1000;
③ 恒溫培養箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒溫裝置:48 ℃±2 ℃;
⑥ 天平:感量 0.1 g;
⑦ 均質器及無菌均質袋、均質杯,振蕩器;
⑧ 試管:15 mm×150 mm、18 mm×180 mm；
⑨ 無菌錐形瓶:容量 500mL;
⑩ 無菌培養皿:直徑 90mm;
⑪ pH 計或精密 pH試紙;
⑫ 無菌接種環:10μL(直徑約3mm);
⑬ RAYPA培養基制動制備分裝儀。

2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液；
② 生理鹽水；
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯；
④ 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯；
⑤ 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
 
三、實驗步驟
1、樣品稀釋
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質杯內,8000 r/min~10000 r/min 均質1 min~2 min，制成 1:10 的樣品勻液。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中充分混勻,制成1:10 的樣品勻液。
③ 必要時用1 mol/l NaOH 或1 mol/L HC1,調節樣品勻液或液體樣品原液的pH至 6.5~7.5之間。
④ 用Pipetty電動移液器吸取1mL的1:10 樣品勻液，沿管壁緩緩注入裝有9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),將試管在振蕩器上振蕩混勻,制成1:100 的樣品勻液。
 
⑤ 根據對樣品污染狀況的估計,參照上述稀釋操作,依次制成 10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支無菌吸管或吸頭。全程依托電動移液器的精準定量功能，避免手工吸液的誤差。
2、接種與培養
① 根據對樣品污染狀況的估計,選取2個~3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種2個無菌培養皿,每皿1mL。同時取磷酸鹽緩沖液或生理鹽水加入2個無菌培養皿作空白對照,每皿1mL。
② 將使用RAYPA培養基自動制備分裝儀提前制備好的VRBA 自動分裝至培養皿中,每皿 15 mL。小心旋轉培養皿將培養基與接種的樣品勻液充分混勻,水平靜置待其凝固。從制備樣品勻液開始至傾注 VRBA 完畢。全過程不得超過 15 min。瓊脂凝固后,再均勻覆蓋3 mL~4 mL VRBA 至整個平板表面。覆層的瓊脂凝固后翻轉平板,置于 36 ℃ ±1 ℃培養 18 h~24 h。對于乳及乳制品,應置于30 ℃±1 ℃培養 18h~24 h。
 
3、平板菌落數的選擇
① 提前調試自動菌落計數儀，根據 VRBA 平板菌落特性，預設核心識別參數，顏色閾值紅色至紫紅色、直徑閾值≥0.5mm 為典型菌落，＜0.5mm 為可疑菌落。
② 將培養后的所有 VRBA 平板批量放入自動菌落計數儀，儀器通過高清圖像采集、智能識別技術，快速完成平板掃描。相比人工計數，可大幅縮短分析時間，實現100個培養皿/小時的高速精準計數，且避免肉眼疲勞導致的計數偏差。測量結果自動輸出為EXCEL文檔，并保存。
 
③ 若儀器識別到 2 個稀釋度的平板菌落數 15~150CFU之間，或出現其他特殊菌落分布情形，按相關規則進行數據初步判定。從同一稀釋度的 VRBA 平板上挑取典型和可疑菌落各5個,典型或可疑菌落少于5個者,則挑取其全部菌落。每個菌落接種1支 BGLB肉湯管,36℃±1℃培養 24h±2h,檢查產氣情況,產氣者為大腸菌群陽性;未產氣者則繼續培養至48h±2h再觀察,產氣者為大腸菌群陽性,仍未產氣者為大腸菌群陰性。
 
四、結果報告
1、所選稀釋度的典型菌落數以及可疑菌落數與各自大腸菌群陽性率的乘積之和的平均值,乘以稀釋倍數,為大腸菌群的菌落數。大腸菌群的菌落數小于100CFU 時,按“四舍五入”的原則修約,以整數報告。大腸菌群的菌落數大于或等于100CFU 時,第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數字。
2、若空白對照上有菌落生長,則此次檢驗結果無效。
3、稱重取樣以 CFU/g為單位報告結果,體積取樣以 CFU/mL為單位報告結果。