SHASHIN KAGAKU自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀在大腸菌群平板計(jì)數(shù)法中的應(yīng)用

方案摘要：本方案基于大腸菌群計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)原理，整合 Pipetty 電動(dòng)移液器與自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀的核心優(yōu)勢(shì)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)全流程。樣品稀釋環(huán)節(jié)，借助 Pipetty 的精準(zhǔn)定量與連續(xù)稀釋功能，高效制備 10 倍遞增系列稀釋液，避免手動(dòng)操作誤差；接種時(shí)通過(guò)其定量接種功能，確保每皿 1mL 接種量精準(zhǔn)一致。培養(yǎng)后采用自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，預(yù)設(shè)菌落識(shí)別參數(shù)，快速篩選有效平板、區(qū)分典型與可疑菌落，計(jì)數(shù)效率較人工大幅提升提升，且支持?jǐn)?shù)據(jù)與圖像存儲(chǔ)追溯。確認(rèn)試驗(yàn)中，依托儀器菌落定位功能精準(zhǔn)挑取目標(biāo)菌落驗(yàn)證。方案大幅提升實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)性、效率性與規(guī)范性，縮短驗(yàn)周期，適用于各類樣品的大腸菌群檢測(cè)，保障數(shù)據(jù)可靠可追溯。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       以 VRBA 培養(yǎng)基為核心，利用膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，僅允許大腸菌群等革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)。大腸菌群發(fā)酵培養(yǎng)基中乳糖產(chǎn)酸，使中性紅指示劑變紅，形成紅色至紫紅色典型菌落（部分帶沉淀環(huán)），實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別。通過(guò)10倍遞增稀釋樣品，讓平板菌落數(shù)落在 15-150 CFU 的可計(jì)數(shù)范圍，再挑取典型/可疑菌落接種 BGLB 肉湯，觀察發(fā)酵產(chǎn)氣情況排除假陽(yáng)性，最終定量樣品中大腸菌群數(shù)量。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器；
② 冰箱:2 ℃~8 ℃；
③ 恒溫裝置:48 ℃±2℃；
④ 天平:感量 0.1 g；
⑤ 均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯,振蕩器；
⑥ 試管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm ；
⑦ 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃；
⑧ 無(wú)菌錐形瓶:容量 500 mL；
⑨ 無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm；
⑩ pH 計(jì)或精密 pH 試紙；
⑪ 無(wú)菌接種環(huán):10μL(直徑約3mm)；
⑫ SHASHIN KAGAKU自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀。
 
2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液；
② 生理鹽水；
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯；
④ 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯；
⑤ 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、稀釋樣品
① 固體和半固體樣品:無(wú)菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min~10000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min。
② 液體樣品:用無(wú)菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中充分混勻。
③ 必要時(shí)用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HC1調(diào)節(jié)樣品勻液或液體樣品原液的 pH 至 6.5~7.5之間。
④ 使用 Pipetty 電動(dòng)移液器，裝配無(wú)菌吸頭，吸取1:10樣品勻液 1mL，沿?zé)o菌試管管壁緩緩注入預(yù)裝有9mL緩沖液/生理鹽水的無(wú)菌試管中（吸頭尖端不觸及稀釋液面）。試管置于振蕩器上振蕩混勻，制成1:100勻液；按樣品污染狀況估計(jì)，重復(fù)上述操作，依次制備10倍遞增系列稀釋液，每遞增稀釋1次，更換1個(gè)無(wú)菌吸頭。
 
2、根據(jù)樣品污染狀況估計(jì)，選取2-3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度（液體樣品可含原液），每個(gè)稀釋度設(shè)置2個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿。使用 Pipetty 電動(dòng)移液器更換新無(wú)菌吸頭，精準(zhǔn)吸取1mL對(duì)應(yīng)稀釋度的樣品勻液，垂直注入培養(yǎng)皿中央，同時(shí)設(shè)2個(gè)空白對(duì)照，每皿注入1mL緩沖液/生理鹽水。
3、盡快向培養(yǎng)皿倒入 48℃±2℃的VRBA培養(yǎng)基，每皿15-20mL，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻，水平靜置待其凝固。凝固后，均勻覆蓋3-4mL VRBA至平板表面，覆層凝固后翻轉(zhuǎn)平板。
4、將平板放入自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀內(nèi)，預(yù)設(shè)顏色閾值：紅色-紫紅色直徑閾值：0.5mm，自動(dòng)掃描平板。儀器自動(dòng)計(jì)測(cè)菌落數(shù)量，并精確轉(zhuǎn)換成CFU，篩選菌落數(shù)在15-150 CFU 之間的有效平板，同時(shí)區(qū)分典型菌落（紅色至紫紅色、直徑≥0.5mm、周圍帶紅色沉淀環(huán)）與可疑菌落（紅色至紫紅色、直徑≤0.5mm），分別統(tǒng)計(jì)數(shù)量并生成計(jì)數(shù)報(bào)告。
 
5、確認(rèn)試驗(yàn)
① 基于自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀的計(jì)數(shù)結(jié)果，精準(zhǔn)挑取目標(biāo)菌落進(jìn)行驗(yàn)證，確保大腸菌群陽(yáng)性結(jié)果的準(zhǔn)確性。
② 從同一稀釋度的 VRBA 平板上，精準(zhǔn)挑取典型和可疑菌落各 5 個(gè)；若典型或可疑菌落少于 5 個(gè)，則挑取全部菌落。
③ 每個(gè)挑取的菌落接種1支BGLB肉湯管，置于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。
④ 培養(yǎng) 24h±2h 后，觀察并記錄產(chǎn)氣情況，產(chǎn)氣者為大腸菌群陽(yáng)性；未產(chǎn)氣者繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h，若產(chǎn)氣仍判定為陽(yáng)性，未產(chǎn)氣則為陰性。
 
四、結(jié)果報(bào)告
1、所選稀釋度的典型菌落數(shù)以及可疑菌落數(shù)與各自大腸菌群陽(yáng)性率的乘積之和的平均值,乘以稀釋倍數(shù),為大腸菌群的菌落數(shù)。大腸菌群的菌落數(shù)小于 100 CFU時(shí),按“四舍五入”的原則修約,以整數(shù)報(bào)告。大腸菌群的菌落數(shù)大于或等于 100 CFU時(shí),第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù)；也可用 10的指數(shù)形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數(shù)字。若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng),則此次檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。
2、稱重取樣以 CFU/g為單位報(bào)告結(jié)果,體積取樣以 CFU/mL,為單位報(bào)告結(jié)果。