急性剪切力在靜脈內皮細胞和人大隱靜脈誘導TWIST介導內皮間充質轉化

Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins

Keywords: CABG; Dexamethasone; EndMT; saphenous vein.

冠狀動脈旁路移植術（CABG）是治療嚴重冠狀動脈疾病的有效方法，其中長隱靜脈/大隱靜脈（LSV）是最常用的導管。然而，LSV移植物的長期通暢率受到內膜增生（IH）發展的限制，這會導致移植物失敗和不良心血管事件。IH是一個多因素影響的過程，當靜脈植入動脈循環時，LSVs暴露于急性血流動力學可能在這一過程中發揮關鍵作用。

內皮間充質轉化（EndMT）與靜脈移植物插入動脈循環后重塑過程中的細胞表型適應調節有關，TGFβ/SMAD信號通路在這一過程中起著重要作用。研究已證明，靜脈（而非動脈）內皮細胞（ECs）急性暴露于動脈剪切應力與不同促炎通路的激活（包括MAPK和NF-kB）有關，從而導致不同促炎分子（如VCAM和MCP-1）的上調。此外，動脈剪切而不是靜脈剪切激活了靜脈ECs中的這種反應。

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糖皮質激素可調節多種重要的心血管、代謝和免疫功能。zhong所周知，糖皮質激素可以顯著抑制TGFβ的產生，并調節SMAD家族和EndMT各種成員的活性。已有研究評估了合成糖皮質激素（人造），如地塞米松（Dexamethasone），在調節血管炎癥和靜脈移植物IH中的作用。

基于此，英國萊斯特大學心血管科學系團隊在最近的一項研究中旨在深入了解急性動脈血流動力學對體外 HUVECs 和離體 LSVs 中 EndMT 激活的影響，并探討地塞米松（Dex）在 LSVs 中調節 EndMT 的作用。研究成果發表于 CELLS 期刊題為“Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins”。

首先，研究了急性層流動脈剪切應力（LSS，0.5 或 12 dyn/cm2分別模擬靜脈和動脈剪切應力）對體外 EndMT 激活的影響。結果觀察到，使用平行板流動室將LSS應用于HUVECs 4小時激活炎癥介質，如MCP-1和CXCL8的表達增加，還注意到血管內皮鈣粘蛋白（VE-CADHERIN）的顯著下調和波形蛋白（VIMENTIN）、TWIST1和TWIST2基因表達的上調（圖1 A）。這些數據表明，ASS 可以觸發 HUVECs 中的 EndMT。

為了檢查TGFβ的作用，使用TGFβ的藥理學抑制劑（SB505124），該抑制劑已知可抑制激活素A受體II型樣激酶（ALK5）。結果觀察到，用抑制劑預處理HUVECs（5μmol / L，60分鐘）4小時后在轉錄物和蛋白質水平上均抑制了對上述表型變化的誘導。這種抑制與早期（45 分鐘）抑制 ALK5 激活和 SMAD 2/3 磷酸化有關。因此，可得出結論，HUVECs 對 LSS 下 TGFβ 依賴性誘導的 EndMT 敏感。

此外，在剪切刺激的HUVECs中使用特異性siRNAs抑制信使RNA表達以評估TWIST轉錄因子TWIST1&2的作用。免疫染色（圖1 E）和WB檢測顯示，沉默 TWIST1 或 TWIST2 抑制 EndMT 會在轉錄水平和蛋白質水平上改變 LSS 下 HUVECs的變化，但不影響上游 ALK5 對 SMAD 2/3 磷酸化的激活，表明TWIST1和TWIST2都可以在體外LSS刺激下的EndMT過程中發揮作用。盡管TWIST1和TWIST2沒有相互調節彼此的表達，但正如在不同條件下所顯示的那樣，在急性動脈血流動力學下，兩者都需要合作來激活反應。

圖1     動脈剪切應力對靜脈內皮細胞（Ecs）中促炎基因和 EndMT 基因的影響。

接下來，使用10μmol/L的Dex預處理60分鐘，注意到HUVEC對LSS的反應發生了顯著變化。Dex預處理導致在45分鐘時抑制ALK5激活和SMAD2/3磷酸化（圖2 A）。此外，它與 TWIST1、TWIST2 和 VIM 的抑制有關，同時免疫染色和 WB檢測顯示，其在轉錄本和蛋白質水平上恢復VE-鈣粘蛋白的表達。這些結果表明，使用Dex可以通過靶向部分ALK5/SMAD/TWIST通路來抑制HUVECs中響應LSS的EndMT變化。

圖2    地塞米松通過剪切應力抑制培養靜脈內皮細胞（Ecs）中的EndMT激活。活。

進一步地，研究人員通過暴露于離體急性動脈流的新鮮采集的人隱靜脈來驗證上述體外發現。對暴露于急性動脈血流動力學4小時的靜脈段進行了空間細胞RNA測序，鑒定出一組同時具有EC和SMC表型（EC/SMC）的細胞，表明它可能代表中間狀態的EndMT。該簇中鑒定出16954個基因，其中，486 個在流動條件下受到顯著差異調節，包括 TWIST2 。當特別關注該簇群中的 TWIST2 網絡分析時，注意到與 TGIF1、FOXC2、CD44、CYP1B1、NFIC、REL 和 FOXC1 等基因的關聯及其后續關聯。這些基因參與炎癥、EndMT、免疫信號傳導、分化和細胞凋亡等過程。

最后，為了驗證上述與 EndMT 相關基因的發現，建立了靶向方法，包括全組織的 RT-PCR 和 RNAscope，并研究了離體Dex 對靜脈進行簡短預處理的影響。除了抑制對急性動脈血流的促炎反應外，使用RT-PCR和RNAscope檢測顯示（圖3 A），Dex預處理在4小時時在轉錄水平上抑制TWIST1和TWIST2的表達，這證明了ECs中兩種RNA轉錄的激活和定位，這些轉錄被Dex處理抑制（圖3 B）。此外，這種簡短的預處理能夠抑制 RNA 上VE-鈣粘蛋白和 VIM 在 ECs 中的 EndMT 表型變化，還顯著調節了TWIST1、TWIST2、VE-鈣粘蛋白和VIM蛋白水平。免疫組織染色顯示，Dex效果還與ALK5表達和SMAD 2/3激活（磷酸化）的快速（45分鐘）顯著降低有關（圖3 E）。有趣的是，當使用 RNAscope 觀察 SNAIL1 轉錄時，注意到 ECs 中沒有激活，僅存在于 SMCs 中，這被 Dex 預處理抑制，表明 TWIST 和 SNAIL 轉錄因子可能對特定細胞類型起作用。

同時，考慮到長時間流動刺激實驗的局限性，還比較了短暫Dex預處理后LSV培養10 天后的效果，發現短暫的單次處理足以在培養后10天抑制EndMT。當比較低流量對LSV ECs激活的作用時，發現低流量不會觸發離體LSVs的任何EndMT變化。總 SMAD 水平也沒有變化。因此，可得出結論，用Dex進行短暫的預處理（60分鐘）可以通過抑制TGFβ / SMAD1通路來抑制LSV ECs中響應剪切應力的EndMT激活。

圖3    用地塞米松預處理人長隱靜脈可抑制內皮細胞（EC）中剪切應力對 EndMT 的激活。

圖4   圖形概要

綜上所述，該研究結果表明，TGFβ-/SMAD-/TWIST1&2 介導的 EndMT 在體外暴露于急性動脈血流動力學時在靜脈移植物內被激活，并且用地塞米松對靜脈進行短暫預處理可以抑制其激活和相關的微鈣化，這可能會調節靜脈移植物內膜增生的發展。盡管這項研究中重點關注ALK5/SMAD通路，但有證據表明糖皮質激素可有效抑制BMP2等骨形態發生蛋白表達。因此，討論 LSVs 中的 EndMT 以及 BMP 在未來研究中的作用將會很有趣。最重要的是，這項研究側重于短期變化，未來將結合空間細胞測序和 RNASCope 等新技術在先前動物研究的基礎上進行擴展，以研究地塞米松短期局部預處理對大型動物模型中 IH 形成的影響。

參考文獻：Ladak SS, McQueen LW, Tomkova K, Layton GR, Murphy GJ, Zakkar M. Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins. Cells. 2025 Sep 2;14(17):1369. doi: 10.3390/cells14171369. PMID: 40940783; PMCID: PMC12428368.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40940783/

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