脂質納米粒(LNP)遞送mRNA的機制及轉染實驗步驟
背景介紹
裸露的RNA是帶負電荷的親水性大分子，因為細胞膜的靜電排斥，難以進入細胞，且易被無處不在的RNA酶快速降解，所以需要保護性外殼才能進入細胞。細胞膜的組成主要是脂質，利用脂質囊泡包封RNA穿過細胞膜并將RNA釋放到細胞質中。囊泡應該是一種帶正電的脂質，才能夠結合帶負電的RNA。
然而，由永久性陽離子脂質組成的囊泡由于能與帶負電的細胞膜發生靜電作用而引起細胞毒性，脂質結構才能夠對內體酸性環境響應而帶正電荷的分子。
脂質納米粒結構
LNP通常由四種關鍵成分組成：可離子化的陽離子脂質、磷脂（兩性離子脂質）(PL)、膽固醇和PEG化脂質。
脂質納米粒遞送機制
脂質納米粒(LNP)作為mRNA的傳遞系統，其作用機制涉及多個步驟，確保mRNA安全有效地遞送到目標細胞并表達蛋白。在LNP中，可電離的陽離子脂質發揮著重要作用，因為它可以帶正電荷低于其Ka以介導在自組裝成LNP期間負載帶負電荷的RNA，在中性pH下不帶電以最大限度地減少毒性，并在細胞吸收后再次帶正電荷以促進內體逃逸隨著內體pH降低。膽固醇和PEG脂質的變體已被證明可以調節LNP物理性質、納米結構和最終功效。兩性離子磷脂通常被稱為“輔助脂質”。LNPs在保護mRNA、促進細胞內傳遞、以及激活免疫反應方面發揮關鍵作用。
LNP轉染實驗步驟
下述轉染步驟中為6孔板單孔參考條件。對于其他培養形式，請參考表1。
將2.5ug mRNA（濃度為1ug/uL）與60uL Buffer混合。
2、mRNA-easyLNP復合物
將62.5uL mRNA預混液與62.5uL easyLNP納米混懸液混合，渦旋2-3s，混勻。
3、加入細胞
將125uL mRNA-easyLNP復合物加入細胞，輕輕晃動使均勻分散。
4、分析時間
培養24-48h后分析。
表1 根據每孔使用的細胞培養容器的mRNA轉染指南
|
mRNA細胞轉染步驟 |
試劑 |
96孔板 |
24孔板 |
6孔板 |
|
（1）40ng/μL mRNA預混液制備 |
Buffer(以mRNA原液濃度1μg/μL為例) |
2.4μL |
12μL |
60μL |
|
mRNA |
0.1μg |
0.5μg |
2.5μg |
|
|
（2）mRNA-easyLNP復合物制備 |
easyLNP納米混懸液 |
2.5μL |
12.5μL |
62.5μL |
|
mRNA預混液 |
2.5μL |
12.5μL |
62.5μL |
|
|
（3）加入細胞 |
mRNA-easyLNP復合物 |
5μL |
25μL |
125μL |
實驗示意圖：
產品推薦：
|
轉染方式 |
貨號 |
品名 |
規格 |
|
細胞 |
mRNA轉染試劑 |
1mL |
|
|
easyLNP™ mRNA免疫細胞轉染試劑盒 |
1.5mL/3mL/5mL |
||
|
easyLNP™ Plus通用型RNA細胞轉染試劑盒 |
1.5mL/3mL/5mL |
||
|
Lipofect5000質粒轉染試劑 |
0.5mL/1.0mL |
||
|
質粒DNA轉染試劑盒(貼壁細胞) |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
PM原代細胞質粒DNA轉染試劑盒 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
SP懸浮細胞質粒DNA轉染試劑盒 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
RF 293細胞DNA轉染試劑盒 |
0.5mL/1.5mL |
||
|
核酸轉染試劑盒 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
PM原代細胞核酸轉染試劑盒 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
SP懸浮細胞核酸轉染試劑盒 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
小核酸轉染試劑 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
PM原代細胞小核酸轉染試劑 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
SP懸浮細胞小核酸轉染試劑 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
核酸共轉染試劑 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
||
|
50nm磁轉染試劑 |
100uL |
||
|
轉染增強劑 |
聚凝胺溶液 |
1mL |
|
|
海美溴銨 |
5g |
||
|
魚精蛋白硫酸鹽 |
5g/25g |
||
|
動物體內 |
easyLNP™ mRNA體內轉染試劑盒(全身作用) |
0.3mL/0.5mL/1mL |
|
|
easyLNP™ mRNA體內轉染試劑盒(局部作用) |
0.3mL/0.5mL/1mL |
||
|
核酸轉染(動物體內) |
Elite Fect-I小核酸活體組織轉染試劑(小鼠轉染) |
3只/6只 |
