大鼠腦間質細胞DITNC1培養(yǎng)使用說明書

一、細胞培養(yǎng)條件

產品名稱	大鼠腦間質細胞DITNC1
生長特性	貼壁生長	凍存條件	無血清凍存液（貨號：C7001）
培養(yǎng)體系	MDMEM+10%FBS+1%P/S
傳代方法	1:2傳代	傳代情況	2天換液
備注	1、收到后及時更換培養(yǎng)基。 2、傳代時用含10% FBS的培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS或1640+10%FBS均可）終止消化并離心收集。

二、細胞收到后處理
培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶，消毒后放到超凈臺內嚴格無菌操作，將細胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認收到狀態(tài)良好。（換液后將瓶蓋擰松）

三、細胞培養(yǎng)步驟
a、細胞傳代：如果未超過80%匯合度時，將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，留5ml完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細胞密度超80%，即可進行傳代培養(yǎng)，傳代具體步驟如下：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 添加1-2ml消化液（0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA）至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，使之完全脫落后吸出，然后將懸液轉移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸。
4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶），補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%CO₂的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
b、細胞凍存：
1、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心 5min；
3、 棄上清，沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001），混勻后加入凍存管中。
4、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要將細胞轉入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉入液氮罐中。
C、細胞復蘇：
1、從液氮中取出細胞凍存管（注意佩戴防護面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2、將凍存管中的細胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種至T25培養(yǎng)瓶，放于37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4、第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

四、注意事項：
有些細胞貼壁不牢，在運輸過程中發(fā)生容易細胞脫落，這是正常現(xiàn)象。可按此方法：將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5min，，沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml完全培養(yǎng)基終止反應。再離心，棄上清，加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25），補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、售后條款：
1）細胞出現(xiàn)問題，可重發(fā)的情況有哪些？判定標準是什么？
1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴重漏液等，重發(fā)；
2. 細胞污染問題，請在收到產品48小時內，給我們提出真實的實驗結果，核實后重發(fā)；
3. 常溫發(fā)貨的細胞靜置24小時后，干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后，絕大多數(shù)細胞未存活，（需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片），重發(fā)；
4. 干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細胞靜置4小時候并且未開封，出現(xiàn)污染，重發(fā)；
5. 細胞活性問題，請在收到產品7天內給我們提出真實的實驗結果，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力，核實后予重發(fā)；
6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照，3天未告知的，視為產品合格。4-7天內出現(xiàn)問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題時照片以及細胞相關操作的詳細步驟的，并跟技術人員溝通的，由技術人員判定為我方責任的，重發(fā)。技術人員判定為雙方承擔責任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā)。
2）細胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些？
1. 客戶造成細胞污染，不重發(fā)；
2. 客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；
3. 非本庫推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；
4. 細胞狀態(tài)不好，未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的，不重發(fā)；
5. 細胞培養(yǎng)時經其它處理的，不重發(fā)；
6. 細胞收到2天內，未告知，不重發(fā)；
7. 視具體情況而定。