文獻解讀：PCSK9通過LIN28A/HES5/JMY軸引發神經管畸形的研究

神經管缺陷（NTDs）是一種復雜的多基因疾病，也是影響中樞神經系統的最常見且嚴重的先天性畸形。研究已發現PCSK9可作為胎兒早期產前診斷NTD的分子標志物，但其導致在神經管發生的具體機制中仍不清楚。2025年8月，來自中國醫科大學附屬盛京醫院的袁正偉研究團隊在期刊Advanced Science（IF: 14.1）上發表了一篇題為“PCSK9 Loss-of-Function Disrupts Cellular Microfilament Network via LIN28A/HES5/JMY Axis in Neural Tube Defects”的研究文章。本研究通過將PCSK9敲除胚胎干細胞（ESC）和PCSK9 R46L點突變的誘導多能干細胞（iPSC）分別引入神經類器官（NOs）和神經祖細胞（NPCs）模型，發現PCSK9缺失通過LIN28A/HES5/JMY軸破壞細胞微絲網絡，最終導致NTDs的發生。這些發現為NTD的發病機制研究和治療策略提供了重要見解。

圖片來源：《Advanced Science》
（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40788992/）

研究材料與方法
本研究前期從臨床檢測數據中發現PCSK9缺失與神經管畸形的發生密切相關，所以通過構建PCSK9敲除ESC和PCSK9 R46L點突變的iPSC（由賽業生物提供），分別結合三維神經類器官和二維神經祖細胞分化體系上，利用轉錄組測序篩選出關鍵分子JMY，并通過染色質免疫沉淀、熒光素酶報告基因等技術證實HES5轉錄激活JMY的表達機制。進一步通過免疫共沉淀和溶酶體抑制實驗，揭示PCSK9作為分子伴侶介導LIN28A的溶酶體降解途徑。并分別在細胞，類器官和斑馬魚模型中，通過基因敲降和過表達實驗驗證了LIN28A/HES5/JMY軸在神經管發育中的關鍵作用及表型可逆性。

技術路線
1. PCSK9 敲除 ESC、PCSK9 R46L 點突變 iPSC
2. 并行培養：

• 神經祖細胞誘導分化培養
• 神經類器官誘導分化培養

3. 轉錄組學測序分析
4. 相關機制驗證分析

研究結果
通過對人腦類器官的單細胞數據分析，發現PCSK9在胚胎發育前兩個月內高表達，隨后迅速下降，后期幾乎檢測不到。該基因主要表達于頂端放射狀膠質細胞（aRG），在部分中間祖細胞和深層投射神經元中低表達，而在其他神經元中極少表達，提示PCSK9在早期神經系統發育中起關鍵作用。

為探究其功能，技術人員構建了PCSK9基因敲除的胚胎干細胞（PCSK9⁻^/⁻ ESC），通過設計靶向第二外顯子的gRNA，實現了11個堿基的缺失，導致移碼突變及提前終止密碼子，影響蛋白質功能結構域。敲除效果經Sanger測序和Western blot驗證。

進一步利用神經類器官（NO）系統比較野生型（WT）與PCSK9⁻^/⁻ ESC的分化過程。結果顯示，PCSK9⁻^/⁻ NOs整體形態較小，神經管（NT）結構發育不完全，周長和表面積均顯著小于WT NOs。這些結果表明，PCSK9缺失會特異性影響神經管發育并導致類器官尺寸減小。

圖1 PCSK9缺失導致NOs大小和NT結構改變

(A)不同發育時間點的人腦類器官中PCSK9表達和統計結果。(B)CRISPR/Cas9介導的PCSK9位點的缺失結果。(C)WT和PCSK9^-/- ESC中PCSK9的表達結果 (D)WT和PCSK9^-/- NO的代表性圖像。(E)NO的直徑、周長和表面積的量化結果。^[1]

對NOs橫截面的免疫熒光染色分析揭示了其內部結構特征。通過SOX2與TBR1共標記，可區分NPCs與成熟神經元。NOs在三個區域形成類神經管（NT）結構：腦室區（VZ，富含NPCs）以及腦室下區/皮質板（SVZ/CP，富含成熟神經元）。在野生型（WT）NOs中，NT結構完整，成熟神經元（TBR1⁺、CTIP2⁺）均勻分布于NPCs周圍；而PCSK9缺失導致成熟神經元減少、NPCs排列紊亂，并阻礙典型環狀NT結構的形成。神經管閉合（NTC）失敗是神經管畸形（NTDs）的重要原因，常伴隨細胞骨架異常。鬼筆環肽染色顯示，PCSK9⁻^/⁻ NOs中NT區域細胞排列混亂，微絲表達增強，符合NTC障礙特征。

為進一步驗證PCSK9與NTDs的關聯，構建了PCSK9 R46L突變體及VANGL2⁻^/⁻ iPSCs來源的NOs（其中PCSK9^R46L和VANGL2^-/- PSCs由賽業生物提供）。免疫熒光顯示，兩者均出現成熟神經元減少及環狀NT結構缺失，表型與PCSK9⁻^/⁻類似。結合單細胞數據庫分析，PCSK9在發育過程中主要定位于頂端放射狀膠質細胞（aRG），屬于NPCs亞群。WT NOs中PCSK9確實富集于SOX2⁺ NPCs區域，其缺失可能引起NPCs分化異常，導致結構畸形。為進一步探究細胞表型，將WT與PCSK9⁻^/⁻ ESCs誘導分化為NPCs進行培養。WT NPCs呈典型長梭形，而PCSK9⁻^/⁻ NPCs則表現為多分支、排列雜亂的異常形態，通常與細胞骨架紊亂相關。微絲染色進一步證實，PCSK9⁻^/⁻ NPCs結構混亂、分支增多，熒光強度增強，說明PCSK9缺失引起NPCs內細胞骨架結構異常。

圖2 PCSK9缺失導致NPC中的細胞微絲紊亂

(A)NOs表現出三種不同的NT結構：心室、心室區 (VZ)和心室下區/皮質板SVZ/CP。(B)WT和 PCSK9^-/- NO中成熟神經元的免疫熒光染色結果。正方形表示NT結構，而白色圓形或不規則形狀表示VZ區域。(C)異常NTC引起的NTD示意圖。(D)WT和 PCSK9^-/- NO的NT結構中細胞微絲的免疫熒光染色結果。(E)熒光染色顯示PCSK9在WT NO的NT結構中的定位和表達結果。(F)NPC誘導培養模型圖。(G)WT 和PCSK9^-/- NPC的代表性光學結果。(H)WT和PCSK9^-/- NPC中細胞微絲的免疫染色結果。[1]

為解析PCSK9缺失引發NT結構異常的機制，研究人員進行了轉錄組測序分析。共鑒定出3764個差異表達基因（DEGs），其中2392個上調、1372個下調。GO富集分析顯示，這些基因在“神經系統發育”等生物學過程，以及“細胞骨架蛋白結合”等分子功能和細胞組分中顯著富集，提示PCSK9缺失主要影響神經發育和細胞骨架調控通路，與前期發現的細胞骨架異常導致NTDs相吻合。

進一步篩選出140個與細胞骨架組裝相關的關鍵DEGs，其中肌動蛋白調控因子JMY表達上調最為顯著。qPCR驗證確認其表達變化具有統計學意義。JMY已知參與Arp2/3復合體介導的微絲成核，由此提出假設：PCSK9缺失通過上調JMY，改變Arp2/3復合體活性，破壞微絲網絡，進而影響細胞形態。免疫熒光染色結果顯示，在WT神經類器官（NOs）中，JMY正常定位并沿微絲分布；而PCSK9⁻^/⁻ NOs的NT結構閉合不全，JMY在細胞核與微絲中廣泛高表達，并在NT結構缺口處異常聚集，伴隨微絲信號增強。在NPCs層面，PCSK9⁻^/⁻組也呈現JMY高表達及多分支紊亂形態。后續功能回復實驗證實，抑制JMY表達可有效挽救PCSK9缺失引起的表型：在PCSK9⁻^/⁻ NPCs中敲低JMY能改善其多分支形態；在NOs中敲低JMY則促進環狀NT結構重建，恢復微絲正常分布，并提高成熟神經元標志物表達。綜上，這些結果表明JMY是PCSK9缺失下游的關鍵效應分子，其失調通過破壞細胞骨架重塑，導致NT結構發育異常。

圖3 PCSK9通過JMY調節NPC中微絲網絡的形成來影響NT結構

(A)GO分析中與生物過程、分子功能和細胞成分相關的項目結果。(B)細胞骨架蛋白項目中所有DEG的熱圖。(C)改變基因的qPCR驗證的統計結果。(D)細胞骨架蛋白的分子功能相關項目。(E,F)JMY和細胞微絲在NOs(E)和NPCs(F)NT結構上的表達和共定位的免疫熒光染色結果。(G)siJMY拯救實驗后WT和PCSK9^-/- NPC中PCSK9和JMY蛋白水平的WB結果。(H,I)WT和PCSK9-/NPC中細胞微絲的免疫熒光染色結果。 (J,K)WT和PCSK9^-/- NT結構中細胞微絲的免疫熒光染色結果。[1]

基于轉錄組數據篩選出三個可能調控JMY的轉錄因子候選，其中HES5顯示出最強的調控潛力。WB實驗顯示，在PCSK9⁻^/⁻組中HES5與JMY表達同步上升，提示HES5可能正向調控JMY。通過JASPAR數據庫預測，發現HES5在JMY啟動子區存在兩個潛在結合位點（#1和#2）。ChIP實驗證實HES5在#1位點處顯著富集。熒光素酶報告基因實驗進一步表明，過表達HES5可顯著增強JMY啟動子活性。為驗證“PCSK9缺失通過HES5上調JMY”的假說，研究人員篩選出高效抑制的HES5 siRNA進行挽救實驗。結果顯示，抑制HES5可同時恢復JMY的表達水平并改善NPCs的異常形態。綜上所述，PCSK9缺失通過轉錄因子HES5正向調控JMY的表達，進而參與神經發育過程中的基因表達調控與細胞形態維持。

圖4 HES5作為轉錄因子調節JMY表達

(A)轉錄組數據庫中FOXA3、HES5和ZNF460表達水平的熱圖。(B)WT和PCSK9^-/- NO中PCSK9、HES5 和JMY蛋白水平的WB結果。(C)HES5-JMY結合位點的預測。(D)JMY啟動子兩個位點HES5富集的ChIP-qPCR分析結果。(E)熒光素酶報告基因實驗驗證HES5表現出針對JMY的轉錄活性；(F)siHES5拯救實驗后NPC中PCSK9、HES5和JMY蛋白水平的WB結果。(G)WT和PCSK9^-/- NPC中細胞微絲的免疫熒光染色結果。^[1]

既往研究表明，PCSK9可作為分子伴侶，通過溶酶體途徑促進靶蛋白降解。基于此，我們推測PCSK9可能通過該途徑調控HES5水平。為探索其機制，我們通過Co-IP聯合質譜分析發現PCSK9與LIN28A存在相互作用，并在PCSK9缺失時內源性LIN28A水平顯著上升。二級質譜及結構對接模擬進一步提示兩者可能直接結合。在PCSK9⁻^/⁻ NPCs中，溶酶體內LIN28A減少，而細胞質及總LIN28A水平升高，提示PCSK9可能促進LIN28A的溶酶體降解。為進一步驗證，我們分別使用CHX抑制蛋白合成和Baf-A1抑制溶酶體活性。結果顯示，在CHX處理下，PCSK9⁻^/⁻組LIN28A降解減慢；而Baf-A1處理后兩組LIN28A水平無差異，說明PCSK9確實通過溶酶體途徑調控LIN28A穩定性。免疫熒光顯示PCSK9與LIN28A及溶酶體標志物LAMP1存在共定位，且PCSK9缺失導致總LIN28A升高。后續功能回復實驗表明，抑制LIN28A可改善PCSK9⁻^/⁻ NPCs的多分支形態，恢復NOs中微絲表達并促進NT結構環狀重建，同時提高成熟神經元標志物水平。綜上，PCSK9缺失通過減少LIN28A的溶酶體降解，進而上調HES5與JMY表達，破壞細胞骨架結構，最終導致神經管形態發生異常。

圖5 PCSK9通過溶酶體途徑促進LIN28A降解來影響NT結構

(A)PCSK9和LIN28A的Co-IP結果。(B)CHX處理后NPC的LIN28A蛋白水平的WB結果。(C)CHX和 Baf-A1處理后NPC的LIN28A蛋白水平的WB結果。 (D,E)NOs(D)和NPCs(E)NT中PCSK9、LIN28A和 LAMP1的免疫熒光結果。(F)siLIN28A救援后NPC 中PCSK9、LIN28A、HES5和JMY蛋白水平的WB結果。(G)siLIN28A救援的NPC中細胞微絲的免疫熒光染色結果。(H)抑制劑1632救援的下NT結構中的細胞微絲的免疫熒光染色結果。(I)NTD中PCSK9/LIN28A/HES5/JMY調節軸介導的細胞微絲網絡組裝改變的簡化示意圖。^[1]

在斑馬魚和哺乳動物中，PCSK9均在外胚層早期發育及神經發生階段持續表達。為探究其功能，他們設計了靶向PCSK9第二外顯子的反義嗎啉寡核苷酸（MO），誘導25-bp缺失以抑制其表達。結果顯示，PCSK9-MO純合胚胎在48 hpf時出現神經管（NT）結構異常，RT-PCR證實其PCSK9轉錄水平顯著下降。盡管PCSK9-MO單獨處理僅引起23%（46/200）的神經管畸形（NTDs）發生率，但進一步實驗發現，過表達JMY mRNA可單獨誘導NTDs，并與PCSK9-MO產生協同作用：聯合處理使NTDs發生率升高至38%（76/200），并伴隨死亡率上升。組織切片顯示，PCSK9-MO斑馬魚表現為神經管縮短、管腔擴張和神經絲紊亂，聯合JMY過表達后這些表型進一步加劇。行為學分析表明，PCSK9-MO及JMY過表達均導致斑馬魚運動能力下降，表現為運動距離、速度和加速度的顯著降低，而聯合處理組上述參數下降更為明顯。綜上，斑馬魚模型中PCSK9缺失可導致神經管發育異常，而JMY過表達不僅單獨誘發NTDs，還可協同增強PCSK9缺失所引起的表型嚴重程度與發生率。

圖6 JMY加重了斑馬魚中PCSK9缺失引起的NTD

(A)針對斑馬魚第二外顯子區域設計PCSK9-MO基礎圖。(B)PCSK9-MO、JMY-mRNA及其聯合給藥對斑馬魚NT發育的影響。(C)PCSK9-MO施用后PCSK9表達的RT-PCR檢測結果。(D)PCSK9-MO、JMY-mRNA和聯合治療組中斑馬魚NTD的發病率和死亡率百分比。(E)給與JMYmRNA后JMY表達的RT-PCR檢測結果。(F)PCSK9-MO、JMY-mRNA和聯合給藥組中斑馬魚活動的熱圖像。(G)PCSK9-MO、JMY-mRNA和聯合給藥組中斑馬魚相關行為的統計分析結果。[1]

研究結論
總的來說，這項研究證明，PCSK9的功能性缺失導致神經管畸形發生是通過LIN28A/HES5/JMY信號軸導致細胞微絲網絡組裝失常的完整信號通路，為NTD的機制研究和臨床干預提供了新靶點。

參考文獻：
[1]Li X, Wang R, Luo W, et al. PCSK9 Loss-of-Function Disrupts Cellular Microfilament Network via LIN28A/HES5/JMY Axis in Neural Tube Defects. Adv Sci (Weinh). Published online August 11, 2025. doi:10.1002/advs.202504291