質粒DNA的酶切實驗步驟

一、實驗目的：
檢測重組質粒是否成功，外源片段是否正確插入到質粒載體中。
二、實驗原理：
限制性核酸內切酶是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。按限制酶的組成、與修飾酶活性關系以及切斷核酸的情況不同，分為三類： 第一類（I型）限制性內切酶、第二類（II型）限制性內切酶和第三類（ III型）限制性內切酶。
現在商業化的內切酶一般都是II型限制性內切酶，具有以下三個特點：

• 識別位點的特異性：每種酶都有其特定的 DNA識別位點，通常是由 4，5，6或 7甚至更多個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。
• 識別序列的對稱性：靶序列通常具有雙重旋轉對稱的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。識別序列有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。

如EcoRI的識別順序為：
5'…… GAA|TTC ……3'
3'…… CTT|AAG …… 5'
垂直線表示中心對稱軸，從兩側“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG。

• 切割位點的規范性： 雙鏈 DNA被酶切后，可形成粘性末端或平末端DNA分子。
  粘性末端：交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵。

如EcoRI的識別順序為：
5'…… G'AA|TT_C ……3'
3'…… C_TT|AA'G …… 5'
_和'表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成5'G………  5'.AATTC，3'CTTAA.和3'……...G二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。　　　　　
平頭末端：在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。
如EcoRV 的識別位置是： 
5'…… GAT'|ATC …… 3'
3'…… CTA'|TAG …… 5' 　
'表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后形成5'…… GAT   ATC …… 3'和3'……CTA和 TAG……5'二個片段，這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。
三、實驗試劑：

• 質粒DNA
• 酶切緩沖液（TaKaRa）
• 限制性內切酶（TaKaRa）
• ddH₂O
• TAE電泳緩沖液
• 瓊脂糖

四、實驗步驟：

• 在微量離心管中配置如下酶切體系：

試劑	使用量（μl）
質粒DNA	5
10X酶切緩沖液	1
限制性內切酶	0.5
ddH2O	2.5

• 適宜溫度反應3小時。
• 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

五、注意事項:

• 質粒酶切所用緩沖液參照試劑目錄選擇。單酶切選用產品附帶的緩沖液，雙酶切根據試劑目錄選擇最適緩沖液。
• 一般1 μg質粒至少加1 U酶，酶切體系中酶的體積不超過1/10。
• 根據試劑目錄選擇最適酶切溫度。