IPS誘導之干細胞培養、誘導神經干細胞分化及腦類器官形成方法和步驟
IPS誘導腦類器官培養分為兩大階段：多能干誘導神經干細胞分化，神經干誘導形成腦類器官。
一、人多能干細胞的培養方法
一、實驗準備
1、人多能干細胞培養基配制
（1）2-8℃解凍hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲存于-20~-80℃，避免反復凍融；
（2）按1:50的比例將 hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細胞培養基(abs9403)；
注意：混勻后的人多能干細胞培養基可在2-8℃穩定儲存2-3周，不建議使用配制已超過3周的人多能干細胞培養基。
（3） 實驗試劑平衡：人多能干細胞培養基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。
注意：培養基中含有因子，不要37℃水浴加熱。
二、操作方法(以下步驟皆應在無菌條件下操作)
hPSC細胞復蘇：
1、實驗操作步驟：
1.1、基質膠包被培養板：取出6孔板/12孔板，每孔內加入1mL/0.5mL即用型基質膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質膠完全覆蓋皿底，置于37℃培養箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內使用。
注意：
① 一支凍存的干細胞的數量在1×106cells/mL 左右，對應6孔板1孔；
② 即用型基質膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質膠液面所及的瓶身，影響基質膠質量。
1.2、先將2-3mL的干細胞培養基加入15mL離心管中備用。
1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1-2min內快速解凍；
注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。
1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細胞培養基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm離心3min；
1.5、重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細胞培養基對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。
1.6、接種：吹吸均勻后，將已經平衡好的即用型基質膠棄掉，將吹打均勻的干細胞懸液加入到已經包被好的6孔板中，并補全每孔2mL培養體系。
1.7、培養：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分布。并置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱培養，第2天觀察細胞貼壁情況；
1.8、換液：從復蘇的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應及時更換新鮮培養基。
多能干細胞(PSCs)集落
hPSC 細胞傳代：
2、實驗具體操作步驟：
2.1、清洗：吸掉原有培養基，貼壁緩慢加入1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養皿邊緣吸去PBS緩沖液；
2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細胞消化液(abs9409)使之覆蓋皿底，并置于37℃培養箱中2-5min；
注意：消化時間依據干細胞生長密度，消化時間略有不同，根據經驗一般建議時間2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內部細胞間出現間隙，即可吸掉消化液終止消化。
2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細胞培養基，用移液槍扇形吹打培養皿底，輕柔吹打3-5次，使皿底干細胞集落脫落，并將其并轉移到15mL離心管中；
注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數在3-5次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正�，F象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
2.4、離心：1000rpm離心3min，棄上清；
2.5、接種：用干細胞培養基吹打細胞5-10次，吸掉包被培養板中的基質膠，并將細胞懸液加入到培養板中，且補全每孔2mL的培養體系。
注意：吹打細胞要溫柔，并且吹打次數不要超過10次。
2.6、換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應及時更換新鮮培養基。
多能干細胞(PSCs)集落染色圖
hPSC 細胞凍存：
3、實驗具體操作步驟：
3.1、清洗：同 2.1；
3.2、消化：同 2.2；
3.3、吹打：同 2.3；
3.4、離心：同 2.4；
3.5、重懸：離心后棄上清，加入2mL ES/iPS細胞凍存液(abs9412)對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3-5次后，將其加入到凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時放回 4℃冰箱。
3.6、記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。
3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。
注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。
3.8、液氮凍存：24h后將-80℃冰箱中的細胞轉移至液氮中長期凍存。
二、人多能干細胞誘導神經干細胞分化方法
誘導培養基準備
1、將冷凍的PSC補充液在2°C-8°C下解凍過夜，或在37°C水浴中快速解凍約5min。
2、解凍后的補充液可分裝成多個相同的等份，并在-5°C至-20°C保存，以制備較小體積的完整培養基。不要重新冷凍解凍。
3、將小瓶輕輕倒置幾次，混合解凍后的補充液。
4、從瓶中取出20mL PSC補充液，轉移到PSC培養基瓶中。旋轉瓶子混合，即得500mL人多功能干細胞(PSC) 誘導神經干培養基(abs9822)，簡稱誘導培養基。
5、誘導培養基可在2°C-8°C保存2周。使用前，在37°C水浴中預熱當天所需量的完整培養基5-10min。
PSC細胞準備
1、按照人多能干細胞的培養方法—hPSC細胞復蘇步驟—1.1-1.8復蘇PSCs。
2、當PSCs達到70-80%的融合度時，去除任何分化和部分分化的克隆。
3、對PSCs進行傳代操作，按照人多能干細胞的培養方法—hPSC細胞傳代步驟—2.1-2.4傳代
4、從新包被的6孔板中吸除包被液，并在每孔中加入2.5mL誘導培養基。
5、輕輕搖動含有誘導細胞懸液的離心管，將PSC以每孔2.5×105 - 3×105的細胞加入包被的6孔板中。例如，如果PSC懸液中的細胞團濃度為1×106個/mL，則在每孔中加入0.25-0.3mL的誘導培養基。
6、快速前后左右移動培養皿，使細胞分散在培養皿表面，并將其輕輕置于37°C、5%CO2的培養箱中。
注意：傳代PSCs 時，細胞應以小團塊的形式接種，而不是單個細胞懸液。避免將PSCs作為單個細胞進行接種，因為這會導致細胞死亡增加。
注意：您可以在分裂時將10μM ROCK抑制劑Y27632加入PSC培養基中過夜，以防止細胞死亡。
神經誘導
1、預熱誘導培養基至室溫。
2、在神經誘導的第0天（PSC傳代后約24h），PSC應達到15-25%的融合度。抽吸廢培養基，在6孔板的每孔中加入2.5mL預熱好的誘導培養基。將培養皿放入37°C、5%CO2的培養箱中。
3、在神經誘導的第2天，細胞集落的形態應該是一致的。標記所有非神經分化克隆，如果有的話，用巴斯德玻璃移液管或移液管尖端去除這些不需要的克隆。抽吸廢培養基，在6孔板的每孔中加入2.5 mL預熱好的誘導培養基。將培養皿放回培養箱。
4、在神經誘導的第4天，細胞將達到融合。任何非神經分化的克隆都應標記并移除。從每孔中抽吸廢培養基，每孔用5mL預熱的誘導培養基代替，將培養皿放回培養箱。
5、在神經誘導的第6天，細胞應接近最大融合。去除任何非神經分化克隆，在每個孔中加入5mL預熱的誘導培養基。將培養皿放回培養箱。
注：在神經誘導的第4-7天，如果細胞的顏色變為褐色， 并且有許多漂浮細胞，說明PSCs的起始密度過高。在這種情況下，每天更換培養基，每孔加5mL誘導培養基。
6、在神經誘導的第7天，NSCs(P0)已經準備好收獲和擴增傳代。
三、人神經干細胞培養方法
準備神經干細胞(NSC)擴增完全培養基
1、NSC完全培養基需要補充NSC補充劑、L-丙氨酰-谷氨酰胺。
2、在無菌環境中，依次將20mL NSC補充劑和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM終濃度）加入到含有480mL NSC培養基中，此時即得神經干細胞(NSC)擴增完全培養基(abs9821)。
3、（可選）在培養基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-鏈霉素）溶液。
注意：在所有成分的有效期限內，在2°C至8°C的黑暗環境中儲存，可穩定長達4周。
注意：可選擇添加200μM抗壞血酸，特別是懸浮培養。
包被孔板
1、基質膠包被培養板：取出6孔板/12孔板，每孔內加入1mL/0.5mL即用型基質膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質膠完全覆蓋皿底，置于37℃培養箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內使用。
2、在使用前，將已經平衡好的即用型基質膠棄掉，然后加入預熱的完全NSC培養基。
NSC傳代
1、當細胞密度達到90-100%的融合度時，丟棄培養瓶中的培養基。
2、用5mL不含鈣和鎂的預溫DPBS洗滌細胞，然后吸棄溶液。
3、在每個培養瓶中加入1.0mL預熱的人多能干細胞消化液(abs9409)，然后在室溫下孵育2-5min。在孵育前確保完全覆蓋細胞。
4、用倒置顯微鏡觀察細胞是否脫離。如有必要，輕拍培養瓶以促進細胞脫離。
5、輕輕上下移液，使團塊分散到單個細胞懸液中。
6、加入9mL預熱好的NSC 完全培養基停止細胞解離反應，然后將細胞懸液轉移到無菌離心管中。
7、200×g離心4min。
8、丟棄上清，然后用適量NSC完全培養基重懸細胞沉淀。
9、用自動細胞計數器測定總活細胞密度。
10、從每個覆蓋層培養瓶中除去覆蓋層溶液，然后加入5mL預熱的NSC完全培養基，添加Y27632（終濃度10μM）。
11、在每個培養瓶中加入5×104細胞/cm2(例如，1.25×106細胞/T-25培養瓶)，然后混合或旋轉細胞懸液以確保均勻分布。
12、于37°C，5%CO2的潮濕環境中孵育。
注：為了獲得最佳性能和細胞生長，每2-3天更換一次培養基，用新鮮的預熱的NSC完全培養基。
NSC凍存
1、準備干細胞凍存液(abs9412)。
2、按照“NSC傳代”中的步驟1至步驟7收集細胞進行冷凍保存。
3、在離心過程中，計算細胞密度為2×106個活細胞/mL所需的最終體積。
注：接下來的步驟需要半體積的室溫NSC培養基和半體積的凍存液。
4、丟棄上清，然后用NSC 完全培養基重懸細胞。
5、加入等量的凍存液，使終濃度為10%DMSO。
6、立即將細胞懸液等分放入凍存瓶中（1mL/瓶）。
7、按照標準程序（每分鐘降低1°C）在自動或手動控制速率的冷凍設備中實現低溫保存。
8、將冷凍細胞轉移到液氮中。
NSC復蘇
1、在37°C水浴中迅速(<2min)解凍細胞。
2、用移液管將凍存液全部移入無菌的15mL離心管中。
3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL預熱好NSC完全培養基，然后輕輕旋轉離心管混合。
4、繼續添加預熱的NSC完全培養基至10mL。
5、200×g離心4min，確認細胞沉淀，丟棄上清。
6、加入5mL預熱好NSC完全培養基重懸細胞沉淀，然后添加Y27632（終濃度10μM），再將離心管的全部內容物轉移到包被的組織培養瓶中。
7、于37°C，5%CO2的潮濕環境中孵育。
8、復蘇后24h用新鮮的預熱過的NSC 完全培養基替換培養基。
注：為了恢復在NSC中生長的細胞，我們建議在初始傳代時以≥1×105個細胞/cm2的密度接種細胞。
四、人神經干細胞誘導形成腦類器官
原代
一、準備工作
1、儀器設備
CO2培養箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床、醫用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）。
2、劑耗材（以腸癌為例）
動物腦類器官培養基試劑盒(abs90050)、基質膠（低因子、無酚紅）(abs9495)、15mL離心管(abs7102)、1.5mL EP管若干(abs7119)、24孔細胞培養板(abs7035)、金屬冰盒。
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組分名稱 |
規格 |
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動物腦類器官培養基A |
100mL |
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類器官原代培養緩沖液B |
250mL |
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原代組織消化液C |
30mL |
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類器官傳代消化液D |
30mL |
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組織保存液E |
100mL |
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類器官凍存液F |
20mL |
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類器官傳代培養緩沖液G |
250mL |
二、操作流程
1、加膠-點板-加液（這里是整個原代操作的點睛之筆）
（1）準備工作
a 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；
c 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。
（2）接種要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養液
（3）接種密度
干細胞團沉淀
消化收集神經干細胞團到15mL離心管，于300g 4℃富集離心5min后移去上清。
密度建議1：基質膠體積：細胞團沉淀體積=25:1（如果估摸細胞團沉淀體積困難，通常加300uL基質膠足夠）
密度建議2：500個細胞團/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）
（4）加膠-點板
向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。
（5）加液
將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養基A進行培養。大概10-14天，多數類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作。
鋪板密度
胎羊及胎鼠類器官生長圖
傳代（消化分兩種情況）
一、類器官數量較多或體積較大傳代步驟
1、類器官收集及洗滌
1）收集：移液器吸去培養基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液G，輕柔吹散基質膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。
2）洗滌：加類器官傳代培養緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。
3）接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：
第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。
第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠類器官混懸液，保留下2/3即可。
促進基質膠和類器官有效分離條件：
a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；
b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。
2、類器官消化
1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺內消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細胞團為主，千萬不要消化成單細胞，單細胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數微升鏡下觀察，如果有較多細胞團可停止消化。
2）添加5倍類器官傳代培養緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質膠殘留，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）
3、加膠-點板-加液
（1）準備工作
a 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；
c 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。
（2）接種要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養液
（3）接種密度
密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，24孔板收集5孔，傳代10孔，需要的基質膠量25*10=250uL
密度建議2：500個細胞團/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）
注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍
（4）加膠-點板
向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。
（5）加液
將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養基 A進行培養。大概10-14天，多數類器官直徑在200-300um，可進行傳代操作。
二、類器官數量不足或體積較小時：
1、類器官收集、吹打、洗滌
1）移液器吸去培養基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液G，輕柔吹散基質膠。
2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣鏡下觀察有較多細胞團時可停止吹打）；
3）洗滌： 24孔板，每5孔為一組，收集在15mL離心管中，加類器官傳代培養緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。
4）接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：
第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留細胞團沉淀即可。
第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠細胞團混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠細胞團混懸液，保留下2/3即可。
促進基質膠和類器官有效分離條件：
a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；
b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。
2、加膠-點板-加液
（1）準備工作
a 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；
c 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。
（2）接種要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養液
（3）接種密度
密度建議1： 對于類器官數量較少的情況，為了維持生長所需的旁分泌信號，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質膠量25*3=75uL
密度建議2：500個細胞團/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）
注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍
（4）加膠-點板
向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。
（5）加液
將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養基 A進行培養。大概7-10天，多數類器官直徑在200-300um，可進行再次傳代。
凍存
凍存要領:
類器官不需要消化（消化后的類器官復蘇活率低）；
在類器官指數增長期凍存（等到該傳代的時候類器官活性比指數期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數類器官直徑在100um-200um，這個時機選擇凍存。
一、類器官收集及洗滌
1、收集：移液器吸去培養基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液G，輕柔吹散基質膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。
2、洗滌：加類器官傳代培養緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。
3、接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：
第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。
第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠類器官混懸液，保留下2/3即可。
促進基質膠和類器官有效分離條件：
a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；
b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。
二、類器官凍存
1、凍存密度，以24孔板為例
密度建議1：2孔/mL凍存液
密度建議2：500個類器官/mL凍存液（如果想計數凍存，可以參照此密度建議）
2、添加適量類器官凍存液F，輕柔吹打重懸，建議立即進行凍存。（放置太久，DMSO對類器官有損傷）
3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
手動凍存：4℃冰箱放置30min，轉移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
復蘇
一、實驗前準備
1、將水浴鍋預熱至37℃；
2、細胞實驗室進行常規消毒，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；
3、在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養板等。
二、取出凍存管
1、根據類器官凍存記錄按標簽找到所需類器官的編號。
2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。
三、迅速解凍
1、迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動，使管中地液體迅速融化。
2、約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內。
四、將類器官凍存液移入15mL離心管，添加10倍體積類器官傳代培養緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃離心5min，棄上清。
五、加膠-點板-加液
1、準備工作
（1）基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；
（3）融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。
2、復蘇要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠類器官混合物，500-750uL類器官培養液
3、復蘇密度
復蘇密度建議1：1:1接種（原來凍幾孔就復蘇幾孔）
復蘇密度建議2：250個類器官/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）
4、加膠-點板
向類器官沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。
5、加液
將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養基A進行培養。大概10-14天，多數類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作。
6、腦類器官鑒定圖
今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！
本期小愛推薦
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貨號 |
品名 |
規格 |
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人多能干細胞培養基 |
500mL |
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人多功能干細胞(PSC)誘導神經干培養基 |
1kit |
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神經干細胞(NSC)擴增培養基 |
1kit |
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人多能干細胞消化液 |
100mL |
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L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(100×,200mM) |
100mL |
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ES/iPS細胞凍存液 |
100mL |
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即用型基質膠 |
100mL |
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Organotial動物腦類器官培養基試劑盒· |
1kit |
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基質膠(低因子,無酚紅) |
1.5mL*8 |
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2mL低溫金屬冰盒(24孔,平底) |
1個 |
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細胞培養板(標準透明6孔板) |
50個/箱 |
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細胞培養板(標準透明24孔板) |
1箱 |
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細胞凍存管 |
1箱 |
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10mL一次性移液管 |
1箱 |
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25mL一次性移液管 |
1箱 |
