SHASHIN KAGAKU自動菌落計(jì)數(shù)儀在大腸菌群平板計(jì)數(shù)法中的應(yīng)用

方案摘要：本方案基于大腸菌群平板計(jì)數(shù)法，結(jié)合 Pipetty 電動移液器與SHASHIN KAGAKU自動菌落計(jì)數(shù)儀核心優(yōu)勢優(yōu)化檢測流程。樣品稀釋與接種階段，Pipetty 憑借精準(zhǔn)定量、防交叉污染及高效移液特性，確保接種量一致性，縮短樣品處理時間，保障稀釋梯度準(zhǔn)確性。培養(yǎng)后，自動菌落計(jì)數(shù)儀通過預(yù)設(shè)顏色、直徑閾值，快速批量掃描 VRBA 平板，自動篩選 15~150CFU 有效平板，精準(zhǔn)區(qū)分典型與可疑菌落，避免人工主觀誤差，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)自動記錄與追溯。提升檢測效率、精準(zhǔn)度與標(biāo)準(zhǔn)化水平，高效完成大腸菌群定量分析，為樣品衛(wèi)生狀況評估提供可靠支撐。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      以 VRBA 培養(yǎng)基為核心，通過膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性雜菌，利用大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使中性紅指示劑變色，形成紅色至紫紅色特征菌落實(shí)現(xiàn)選擇性分離。樣品經(jīng)梯度稀釋后接種，在適宜溫度下培養(yǎng)，挑取特征菌落接種 BGLB 肉湯，通過發(fā)酵產(chǎn)氣確認(rèn)陽性菌株，排除假陽性。最終選取 15~150 CFU 的有效平板，結(jié)合稀釋倍數(shù)和接種體積計(jì)算樣品中大腸菌群數(shù)量，評估樣品衛(wèi)生狀況。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① SHASHIN KAGAKU自動菌落計(jì)數(shù)儀;
② Pipetty 電動移液器MSIC01-03-1000;
③ 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒溫裝置:48 ℃±2 ℃;
⑥ 天平:感量 0.1 g;
⑦ 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯,振蕩器;
⑧ 試管:15 mm×150 mm、18 mm×180 mm；
⑨ 無菌錐形瓶:容量 500mL;
⑩ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm;
⑪ pH 計(jì)或精密 pH試紙;
⑫ 無菌接種環(huán):10μL(直徑約3mm);
⑬ RAYPA培養(yǎng)基制動制備分裝儀。

2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液；
② 生理鹽水；
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯；
④ 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯；
⑤ 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣品稀釋
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min~10000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min，制成 1:10 的樣品勻液。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中充分混勻,制成1:10 的樣品勻液。
③ 必要時用1 mol/l NaOH 或1 mol/L HC1,調(diào)節(jié)樣品勻液或液體樣品原液的pH至 6.5~7.5之間。
④ 用Pipetty電動移液器吸取1mL的1:10 樣品勻液，沿管壁緩緩注入裝有9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),將試管在振蕩器上振蕩混勻,制成1:100 的樣品勻液。
 
⑤ 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),參照上述稀釋操作,依次制成 10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支無菌吸管或吸頭。全程依托電動移液器的精準(zhǔn)定量功能，避免手工吸液的誤差。
2、接種與培養(yǎng)
① 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),選取2個~3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種2個無菌培養(yǎng)皿,每皿1mL。同時取磷酸鹽緩沖液或生理鹽水加入2個無菌培養(yǎng)皿作空白對照,每皿1mL。
② 將使用RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀提前制備好的VRBA 自動分裝至培養(yǎng)皿中,每皿 15 mL。小心旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿將培養(yǎng)基與接種的樣品勻液充分混勻,水平靜置待其凝固。從制備樣品勻液開始至傾注 VRBA 完畢。全過程不得超過 15 min。瓊脂凝固后,再均勻覆蓋3 mL~4 mL VRBA 至整個平板表面。覆層的瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板,置于 36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。對于乳及乳制品,應(yīng)置于30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18h~24 h。
 
3、平板菌落數(shù)的選擇
① 提前調(diào)試自動菌落計(jì)數(shù)儀，根據(jù) VRBA 平板菌落特性，預(yù)設(shè)核心識別參數(shù)，顏色閾值紅色至紫紅色、直徑閾值≥0.5mm 為典型菌落，＜0.5mm 為可疑菌落。
② 將培養(yǎng)后的所有 VRBA 平板批量放入自動菌落計(jì)數(shù)儀，儀器通過高清圖像采集、智能識別技術(shù)，快速完成平板掃描。相比人工計(jì)數(shù)，可大幅縮短分析時間，實(shí)現(xiàn)100個培養(yǎng)皿/小時的高速精準(zhǔn)計(jì)數(shù)，且避免肉眼疲勞導(dǎo)致的計(jì)數(shù)偏差。測量結(jié)果自動輸出為EXCEL文檔，并保存。
 
③ 若儀器識別到 2 個稀釋度的平板菌落數(shù) 15~150CFU之間，或出現(xiàn)其他特殊菌落分布情形，按相關(guān)規(guī)則進(jìn)行數(shù)據(jù)初步判定。從同一稀釋度的 VRBA 平板上挑取典型和可疑菌落各5個,典型或可疑菌落少于5個者,則挑取其全部菌落。每個菌落接種1支 BGLB肉湯管,36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h,檢查產(chǎn)氣情況,產(chǎn)氣者為大腸菌群陽性;未產(chǎn)氣者則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h再觀察,產(chǎn)氣者為大腸菌群陽性,仍未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。
 
四、結(jié)果報告
1、所選稀釋度的典型菌落數(shù)以及可疑菌落數(shù)與各自大腸菌群陽性率的乘積之和的平均值,乘以稀釋倍數(shù),為大腸菌群的菌落數(shù)。大腸菌群的菌落數(shù)小于100CFU 時,按“四舍五入”的原則修約,以整數(shù)報告。大腸菌群的菌落數(shù)大于或等于100CFU 時,第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數(shù)字。
2、若空白對照上有菌落生長,則此次檢驗(yàn)結(jié)果無效。
3、稱重取樣以 CFU/g為單位報告結(jié)果,體積取樣以 CFU/mL為單位報告結(jié)果。