RAYPA培養基自動制備分裝儀在大腸埃希氏菌平板計數法中的應用

方案摘要：本方案圍繞大腸埃希氏菌檢測流程優化，深度融合 RAYPA 培養基自動制備分裝儀核心優勢，提升檢測效率與準確性。培養基制備環節，儀器可實現自動加熱溶解、48℃±2℃精準控溫及 15-20mL / 皿定量分裝，避免人工操作導致的濃度不均、溫度波動等問題。儀器保障培養基均一性，讓藍綠色典型菌落更易識別，結合規范計數規則，顯著提升結果重復性。整體方案通過自動化升級，簡化操作步驟、減少人為誤差，為大腸埃希氏菌檢測提供高效可靠的解決方案。
 
 
方案詳情：
一、實驗原理
       通過梯度稀釋樣品，降低菌液濃度以避免菌落重疊，再將稀釋液接種至選擇性培養基。該培養基可抑制雜菌生長，僅允許大腸埃希氏菌繁殖，培養后單個或一群大腸埃希氏菌形成可見菌落。通過計數符合特征的菌落，結合菌落形成單位（CFU）換算樣品中該菌濃度，同時借助生化反應確認菌種，確保計數結果準確。
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
① RAYPA培養基自動制備分裝儀;
② Pipetty Pro 非等量電動移液器:MSIC12-01-1000;
③ 恒溫培養箱:36 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒溫水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
⑥ 恒溫裝置:48 ℃±2℃;
⑦ 天平:感量 0.1g;
⑧ 均質器及無菌均質袋、均質杯,振蕩器;
⑨ 試管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm 、以及小倒管(杜氏管）;
 ⑩ 無菌錐形瓶:容量 500 mL;
⑪ 無菌培養皿:直徑 90 mm;
⑫ pH 計或精密 pH 試紙;
 ⑬ 無菌接種環:10 μL。
 
2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液;
② 生理鹽水;
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯;
④ EC 肉湯;
⑤ 胰蛋白胨膽鹽 X-葡萄糖醛酸苷(TBX)瓊脂;
⑥ 1 mol/I NaOH;
⑦ 1 mol/L HCl。
 
三、實驗步驟
1、樣品的稀釋
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000 r/min~10 000 r/min 均質1 min~2 min;或放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1 min~2 min,制成 1:10 的樣品勻液。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶中充分混勻,或放入盛有 225ml,磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2 min,制成1:10的樣品勻液。
③ 必要時用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HC1,調節樣品勻液或液體樣品原液的 pH 至 6.5~7.5。
④ 用Pipetty電動移液器吸取1:10 樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入裝有9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中,將試管在振蕩器上振蕩混勻,制成1:100的樣品勻液。
 
⑤ 根據對樣品污染狀況的估計,依次制成 10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支無菌吸頭。
2、樣品接種準備
根據對樣品污染狀況的估計，選取2個~3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液。使用Pipetty電動移液器，向每個選定稀釋度對應的2個無菌培養皿中各接種1mL樣品勻液。同時，取磷酸鹽緩沖液或生理鹽水1mL加入2個無菌培養皿作為空白對照。
3、培養基制備與傾注培養
① 培養基制備：將TBX瓊脂干粉與定量無菌水按配方比例加入RAYPA培養基自動制備分裝儀內，通過儀器觸控屏設定制備參數。儀器可實現培養基的自動加熱溶解、精準控溫攪拌，確保瓊脂完全溶解且濃度均勻，避免人工制備時因加熱不均導致的培養基質量波動。
 
② 溫度精準控制：儀器內置高精度溫控系統，可將制備完成的TBX瓊脂自動恒溫至48℃±2℃的最佳傾注溫度，無需人工反復測溫調整，徹底解決傳統水浴控溫效率低、溫度波動大的問題。
③ 自動分裝傾注：在接種完成后，通過儀器觸控屏設定分裝體積（15mL~20mL/皿），啟動自動分裝程序。儀器的精準分裝泵保證各培養皿中培養基厚度一致，為菌落生長提供均一環境，并避免人工接觸造成的污染。
 
④ 混勻與凝固：將培養皿進行輕柔旋轉混勻，確保培養基與接種的樣品勻液充分接觸且無氣泡產生；隨后將培養皿水平靜置，待其凝固。
⑤ 培養銜接：瓊脂凝固后，將平板翻轉，置于36℃±1℃的恒溫培養箱中培養18h~24h。若采用RAYPA儀器配套的一體化培養模塊，可直接通過儀器設定培養參數，實現從分裝到培養的無縫銜接，進一步提升操作效率。
4、平板菌落數的選擇
TBX瓊脂平板上大腸埃希氏菌的典型菌落為藍綠色,選擇典型菌落數在 15 CFU~150 CFU 之間的平板,對典型菌落進行計數。
5、大腸埃希氏菌菌落數的計算
① 若只有1個稀釋度的平板上典型菌落數在計數范圍內,以該稀釋度典型菌落數的平均值,再乘以相應稀釋倍數進行結果計算。
② 若有兩個連續稀釋度的平板上典型菌落數在計數范圍內時,結果按式(1)計算:
 
③ 若所有稀釋度的平板上典型菌落數均大于 150 CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他稀釋度的平板菌落數可記錄為多不可計,結果按最高稀釋度典型菌落數的平均值乘以相應稀釋倍數計算。
④ 若所有稀釋度的平板上典型菌落數均小于15 CFU,則對稀釋度最低的平板進行計數,結果按最低稀釋度典型菌落數的平均值乘以相應稀釋倍數計算。
⑤ 若所有稀釋度平板均無典型菌落生長,則結果按小于1乘以最低稀釋倍數計算。
⑥ 若所有稀釋度的平板上典型菌落數均不在 15 CFU~150 CFU之間,其中一部分小于 15 CFU一部分大于 150 CFU 時,則以最接近 15 CFU或 150 CFU 的典型菌落數平均值乘以相應的稀釋倍數進行結果計算。
 
四、結果報告
1、大腸埃希氏菌的菌落數小于 100 CFU 時,按“四舍五入”的原則修約,以整數報告。
2、大腸埃希氏菌的菌落數大于或等于 100 CFU時,第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2 位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數字。
3、若空白對照上有菌落生長,則此次檢驗結果無效。
4、稱重取樣以 CFU/g為單位報告結果,體積取樣以 CFU/ml, 為單位報告結果。