RAYPA培養基自動制備分裝儀在大腸埃希氏菌MPN計數法的應用

方案摘要：借助 RAYPA 培養基自動制備分裝儀完成檢測所需各類培養基/緩沖液的制備與分裝，替代傳統手動操作，實現“稱量-溶解-滅菌-分裝-冷卻”全流程自動化控制，保障無菌性與定量一致性。本方案以“樣品處理-梯度稀釋-三級發酵-結果判定”為核心邏輯，融入RAYPA培養基自動制備分裝儀優勢優化檢測流程。前期依托儀器實現全自動化制備分裝，后續樣品處理以 RAYPA 預制液為基質，確保 1:10 及系列稀釋精準；初發酵、復發酵、確認試驗依托標準化培養基，保障產氣觀察、菌落識別準確。最終結合 MPN 檢索表報告結果，因儀器保障各環節精準無菌，檢測重復性與準確性顯著提升，適配多批次檢測需求。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       大腸埃希氏菌 MPN 計數法，核心是基于概率統計的數量估算方法。其原理為：先對樣品做 10 倍梯度稀釋，選取連續稀釋度各接種多支選擇性培養管；經培養后，依據大腸埃希氏菌分解乳糖產酸產氣的特性判斷陽性管；最后根據各稀釋度陽性管分布組合，結合泊松分布原理，查閱 MPN 表推算出樣品中該菌的最可能數量。
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
① RAYPA培養基自動制備分裝儀;
② Pipetty Pro 非等量電動移液器:MSIC12-01-1000;
③ 恒溫培養箱:36 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒溫水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
⑥ 恒溫裝置:48 ℃±2℃;
⑦ 天平:感量 0.1g;
⑧ 均質器及無菌均質袋、均質杯,振蕩器;
⑨ 試管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm 、以及小倒管(杜氏管）;
 ⑩ 無菌錐形瓶:容量 500 mL;
⑪ 無菌培養皿:直徑 90 mm;
⑫ pH 計或精密 pH 試紙;
⑬ 無菌接種環:10 μL。
 
2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液;
② 生理鹽水;
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯;
④ EC 肉湯;
⑤ 胰蛋白胨膽鹽 X-葡萄糖醛酸苷(TBX)瓊脂;
⑥ 1 mol/I NaOH;
⑦ 1 mol/L HCl。
 
三、實驗步驟
1、實驗前準備
① 通過 RAYPA 儀器自動完成磷酸鹽緩沖液、生理鹽水的制備與定量分裝（精準設定 225mL /份、9mL/份規格），儀器內置無菌程序，避免手動分裝污染，同時為后續樣品稀釋提供精準基質。
 
② RAYPA 自動完成原料稱量、高溫滅菌后，將LST 肉湯及EC 肉湯精準分裝至無菌試管，分裝過程全程密閉，避免雜菌污染，且每管培養基液面高度一致，保障產氣觀察準確性。​
③ RAYPA自動完成瓊脂溶解、溫度調控后，定量分裝至無菌培養皿內，避免手動傾倒導致的厚度不均問題，保障后續菌落觀察清晰度。
 
2、樣品處理與梯度稀釋
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000 r/min~10 000 r/min 均質1 min~2 min;或放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1 min~2 min,制成 1:10 的樣品勻液。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中充分混勻,或放入盛有 225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2 min,制成1:10的樣品勻液。
③ 必要時用1 mol/L, NaOH 或1 mol/L HC1,調節樣品勻液或液體樣品原液的 pH 至 6.5~7.5。
④ 用移液器吸取1:10 樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入裝有9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中,將試管在振蕩器上振蕩混勻,制成1:100的樣品勻液。
 
⑤ 根據對樣品污染狀況的估計,依次制成 10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支無菌吸頭。
3、初發酵試驗
每個樣品,選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液,每個稀釋度接種3管LST肉湯,每管LST肉湯接種1mL樣品勻液。從制備樣品勻液開始至接種至LST肉湯完畢,全過程不得超過15 min。將已接種樣品的 LST肉湯管置于 36 ℃±1 ℃培養 24 h±2h,檢查產氣情況。小倒管或產氣收集裝置內有氣泡產生,或輕輕振搖LST肉湯管可見試管內有細密氣泡不斷上升者,判斷為產氣,產氣者進行復發酵試驗。如未產氣則繼續培養至 48 h±2h,產氣者進行復發酵試驗;培養至48 h+2h,仍未產氣者判斷為大腸埃希氏菌陰性。若培養至 48 h±2h,所有LST肉湯管均未產氣,MPN 檢索表,報告每克(毫升)樣品中大腸埃希氏菌的 MPN值,以 MPN/g(mL)表示。 
4、復發酵試驗
輕輕振搖各產氣的LST肉湯管,分別用接種環取培養物1環,轉種至EC肉湯管中,放入帶蓋的水浴箱內。水浴箱的水面至少高于 EC肉湯培養基液面1cm~2cm,44.5 ℃±0.2 ℃培養 24 h±2h,檢查產氣情況,如未見產氣則繼續培養至 48 h±2 h。記錄 48 h±2h內所有產氣的 EC肉湯管數,并進行確認試驗。若培養至 48 h±2 h,所有 EC肉湯管均未產氣,判斷為大腸埃希氏菌陰性,按照MPN 檢索表,報告每克(亳升)樣品中大腸埃希氏菌的 MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。
5、確認試驗
輕輕振搖各產氣的 EC肉湯管,分別用接種環取培養物劃線接種于 TBX瓊脂平板,36 ℃±1℃培養 18 h~24 h,觀察 TBX瓊脂平板上的菌落,大腸埃希氏菌在 TBX 瓊脂平板上的菌落為藍綠色。TBX瓊脂平板上有藍綠色菌落者,其對應的EC肉湯產氣管為大腸埃希氏菌陽性,否則為陰性。
 
四、結果報告
依據3個適宜的連續稀釋度中大腸埃希氏菌的陽性管數,按照MPN 檢索表。報告每克(毫升)樣品中大腸埃希氏菌的 MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。