PCR、RT-PCR、qPCR、RT-qRCR、ddPCR幾種技術的原理及區別

聚合酶鏈反應(PCR，Polymerase Chain Reaction)由Kary Mullis博士于20世紀80年代開發。該技術因其識別特定DNA序列并快速準確地合成大量副本的能力而被比作“分子復印機”。目前開發了各種基于原始PCR方法的衍生技術。實時PCR，也稱為定量PCR(qPCR)，將PCR放大和檢測結合在一步中。另一種稱為逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的技術使用RNA作為核酸起始模板。

● PCR：包含DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs的反應混合物的重復加熱和冷卻循環。[1]每個循環都會使DNA的數量增加一倍左右，因為在下一個循環中，一條新的DNA鏈會成為復制的模板。這導致DNA數量呈指數增長。

圖1 PCR的第一個循環[1]

● RT-PCR(Reverse transcription PCR)：反轉錄PCR可以使用RNA作為模板，生成互補DNA(cDNA)。使用逆轉錄酶可生成cDNA的單鏈拷貝。這可以使用與RNA的PolyA尾部相結合的寡聚體(dT)引物，或使用隨機六聚體（六至九個堿基長的引物，在RNA轉錄物的多個點上進行結合）來完成。一般來說，兩種引物的混合被認為是最好的，因為它能夠放大PolyA尾RNA（主要是mRNA）和不含PolyA的RNA（tRNA、rRNA等）。然后再用DNA聚合酶進行擴增，生成雙鏈cDNA，送入基于PCR的標準擴增過程。

● qPCR(Quantitative PCR)：是指定量實時PCR，即實時對DNA進行PCR擴增，通過熒光探針（最常見的是插層染料或水解探針）進行測量，從而對PCR產物進行定量。用于檢測病原體的存在，并確定相關DNA序列的拷貝數。SYBR Green I是最常用的DNA結合熒光染料，當與雙鏈DNA結合時會發出熒光，熒光強度與PCR產物的濃度成正比增長。

與標準PCR相比，定量PCR的優勢在于無需瓊脂糖凝膠就能實時觀察到哪些反應起了作用。它還能進行真正的定量分析。

● RT-qPCR(Reverse Transcription Quantitative real-time PCR)：這是一種將RT-PCR與qPCR相結合的技術，用于反轉錄定量實時PCR。通過在qPCR反應中使用cDNA來測量RNA水平，從而快速檢測基因表達的變化。

RT-qPCR可用于研究用抑制劑、刺激劑、小干擾RNA(siRNA)或基因敲除模型等處理模型系統時基因表達的變化。這項技術還經常用于檢測RNA-Seq實驗之前（作為質量控制）和之后（確認變化）的表達變化。

RT-qPCR樣品制備的最后一步是產生cDNA。除了考慮引物外，cDNA的生成可以是qPCR實驗（稱為一步RT-qPCR）的一部分，也可以與qPCR（兩步RT-qPCR）分開生成（圖3）。

圖2 RT-PCR, qPCR and RT-qPCR示意圖 [2]

圖3 一步法RT-qPC和兩步法RT-qPCR[2]

● ddPCR(Droplet-based Digital PCR)：樣本穿過微流控芯片形成一種分段流，其中樣本被分成數萬個液滴可以充當PCR反應室，這些液滴被不混溶的液體（例如礦物油）分離，形成乳液[3]。將乳液收集在小瓶中，進行PCR，隨后通過流式細胞儀處理樣本，以計數PCR陽性的液滴數量。或將乳液送入塑料芯片中，形成單層液滴，進行熱循環并捕獲并評估液滴的熒光圖像[4]。與qPCR相比，ddPCR具有精確度更高、絕對定量變異系數更低的優點[5]。PCR多重化通常通過基于探針的熒光進行，每個DNA/RNA具有不同的激發顏色。也用于生成單細胞RNA測序的庫。

圖4 ddPCR示意圖[6]

參考文獻：
[1] Jalali M, Zaborowska J, Jalali M. The polymerase chain reaction: PCR, qPCR, and RT-PCR[M]//Basic science methods for clinical researchers. Academic Press, 2017: 1-18.
[2] Zhang H, Tang K, Wang B, Duan CG, Lang Z, Zhu JK. Protocol: a beginner's guide to the analysis of RNA-directed DNA methylation in plants. Plant Methods. 2014 Jun 14;10:18. doi: 10.1186/1746-4811-10-18. PMID: 24955108; PMCID: PMC4065543.
[3] Schiffman M, Bauer H, Lorincz A et al. Comparison of Southern blot hybridization and polymerase chain reaction methods for the detection of human papillomavirus DNA. J. Clin. Microbiol.29(3), 573–577 (1991).
[4] Madic J, Zocevic A, Senlis V et al. Three-color crystal digital PCR. Biomol. Detect. Quant. 10, 34–46 (2016).
[5] Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat. Methods 10, 1003 (2013).
[6] Hwang B, Lee JH, Bang D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 2018 Aug 7;50(8):1-14. doi: 10.1038/s12276-018-0071-8. Erratum in: Exp Mol Med. 2021 May;53(5):1005. doi: 10.1038/s12276-021-00615-w. PMID: 30089861; PMCID: PMC6082860.