PolySeq.AI利用3種質譜技術實現多克隆抗體從頭測序99%+準確率
首個多克隆抗體從頭測序軟件！PolySeq.AI利用3種質譜技術實現99%+準確率
你有沒有想過：為什么有些抗體能對抗病毒突變，卻一直沒法大規模用在新藥里？答案源自多克隆抗體(pAb)”的特性，它能識別抗原的多個位點，比單克隆抗體(mAb)更抗突變，卻因為成分太復雜，一直面臨“測序難”的困境：要么依賴稀缺的B細胞，要么靠現有數據庫“猜”，結果又慢又不準，而且通過質譜直接測序，數據又過于復雜幾乎無法拼接。但在我們Bioinformatics Solutions Inc.(BSI)研究團隊的不斷努力下，這個卡脖子多年的難題終于迎來了重大突破！10月13日，題為“Sequencing of Polyclonal Antibodies by Integrating Intact Mass, Middle-Down and De Novo Bottom-Up Mass Spectrometry”的文章正式上線Molecular & Cellular Proteomics，將bottom-up、middle-down和intact mass質譜技術“三招聯用”，實現了多克隆抗體的全自動、無數據庫測序，準確率高達99%+，開啟多克隆抗體新藥研發的新紀元！
BSI團隊的Lei Xin, Wenting Li , Shuyang Zhang 為共同第一作者，Baozhen Shan和Ming Li院士為本文通訊作者，該工作囊括了算法，軟件開發，液相分離技術和質譜多個小組的共同協作。
圖1 PolySeq.AI流程示意圖
先搞懂：多克隆抗體為啥“好用卻難測”？
首先，要了解“單克隆”和“多克隆”的區別：
◆單克隆抗體(mAb)：成分單一，能精準盯緊一個抗原位點，測序容易、批次穩定，是現在很多抗癌藥、單抗藥的首選。
◆多克隆抗體(pAb)：是B細胞“批量生產”的混合抗體，能同時盯緊抗原的多個位點，這意味著它更能適應病毒突變(比如新冠變異株)，還能檢測低濃度抗原，在抗蛇毒血清、ELISA檢測里非常適用。
圖2 單抗和多抗的結合示意
pAb的“混合性”在結合廣泛的同時，也帶來了硬傷，那就是成分復雜、批次差異大，想測清楚它的氨基酸序列，以前要么靠“查字典”(比對已知的B細胞數據庫，很多時候還查不到)，要么靠手動拼接，不僅慢，還容易出錯，直接限制了它在新藥里的應用。
PolySeq.AI的“破局秘訣”：三招質譜技術聯用
PolySeq.AI的核心優勢，就是真正的實現了不依賴任何外部數據庫，只靠質譜數據完成多抗序列的解析和拼接，而且全程自動化的從頭測序，將濕實驗和數據分析有機結合。它的操作邏輯可以總結為“先拆后拼，層層驗證”(圖3)。
圖3 結合intact mass、bottom-up、middle-down的pAb從頭測序分析流程
Step 1–樣本制備及三種質譜數據采集
先把抗體樣本進行預處理(比如切糖、切開鉸鏈區等)，然后用三種質譜技術分別獲取關鍵信息：
◆Intact Mass：看抗體的整體分子量，大致確定有多少種抗體形式，指導后續實驗方向及為后續算法拼接提供依據；
◆Middle-down：把抗體拆成20-30kDa的中等片段(比如輕鏈、Fc片段)，捕捉片段的關鍵結構信息；
◆Bottom-up：把抗體拆成更小的肽段，像拼圖的小碎片一樣，為后續拼接提供 “細節素材”。
拿到三種質譜數據后，PolySeq.AI根據以下步驟完成拼接，整個過程無需借助任何數據庫，以前需要一個經驗豐富的專家花十天半個月都不一定能處理完的工作，現在只需幾小時就能搞定。
◆用bottom-up的多肽構建“重疊圖庫”，先拼出初步序列；
◆用middle-down的片段信息“校準”，篩選出最匹配的序列組裝路徑；
◆最后用intact mass數據“收尾”，把中等片段拼成完整的抗體鏈(輕鏈、重鏈)，最后還能自動糾正氨基酸的錯配問題(比如區分亮氨酸Leu和異亮氨酸Ile，N和GG這類isobaric錯誤)。
硬核驗證：兩組實驗結果“實錘”準確率
光說不練假把式，我們的實驗團隊用兩組不同的實驗直接驗證了PolySeq.AI的實力。
HB-95細胞系能產生針對HLA-I復合物的抗體，用單克隆抗體測序方法只能測出部分序列，但從intact mass的解卷積結果中，可以明確看到有3種組合形式(圖4)。用PolySeq.AI方案不僅準確組裝出了3種完整的抗體形式(2種輕鏈+1種重鏈的組合)，并且與NCBI數據庫比對，我們給出的序列與已知的抗體片段匹配率達到了100%。然后，我們把測序結果通過重組表達后，產物能精準結合HLA-I復合物，足以證明準確性。
圖4 HB95 intact mass解卷積的三種抗體組合
實驗2：4種已知單抗的模擬混合液測序
我們把4種臨床常用的單抗：貝伐單抗(Avastin)、阿達木單抗(Humira)、利妥昔單抗(MabThera)和曲妥珠單抗(赫賽汀)，按3:2:1:1比例混合，模擬復雜的多克隆抗體環境，通過PolySeq.AI實現了超過99%的測序準確率，含量低于5%的抗體也能準確測定。其中，bottom-up的肽段覆蓋度達到100%，middle-down的片段匹配度也超過了50%。
圖5 四種抗體混合物的測定序列
PolySeq.AI的突破，到底意味著什么？
PolySeq.AI的突破貢獻，不僅僅只是“測準了序列”，更給生物醫藥領域帶來了兩個關鍵改變：
◆解決pAb的“批次難題”：以前pAb因為序列不清，批次差異大，沒法大規模用于臨床；現在能精準測序，就能通過重組技術批量生產“標準化”的pAb，使得抗蛇毒血清、抗病毒cocktail療法等都能更穩定的應用。
◆加速新藥研發：對于未知的抗體(比如新病毒的中和抗體），不用再花費大量的時間和費用成本尋找B細胞、建數據庫，關鍵是避免搜庫的偏向性，直接用PolySeq.AI測序，就能快速拿到序列，極大地加快了后續藥物的研發過程。
從“測不準”、“測不了”到“99%+準確率”，PolySeq.AI靠“三招質譜技術+AI拼圖”，終于把多克隆抗體的“密碼本”破譯了。這不僅是質譜技術和AI結合的勝利，更讓我們看到，那些曾經因為復雜、難測而讓科學家們束手無策的生物大分子，未來真的有可能成為造福疾病患者的良藥。未來，我們會進一步提升低豐度抗體的檢測靈敏度，甚至拓展到更復雜的蛋白質混合物測序，為對抗傳染病、癌癥增添一把“精準武器”。
作為生物信息學的領軍企業，BSI專注于蛋白質組學和生物藥領域，通過機器學習和先進算法提供世界領先的質譜數據分析軟件和蛋白質組學服務解決方案，以推進生物學研究和藥物發現。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質組學、基因組學和醫學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數千家學術和工業用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發現服務和抗體綜合表征服務等。聯系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
