案例分享：利用高通量篩選策略發(fā)現(xiàn)新型Myc分子膠降解劑

癌蛋白 c-Myc（Myc） 是一種 DNA 結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄激活因子，在細(xì)胞周期調(diào)控、生長、分化、發(fā)育等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其失調(diào)可使癌細(xì)胞逃避生長抑制、免疫清除、促進(jìn)腫瘤相關(guān)炎癥并引起基因組不穩(wěn)定與突變。

由于Myc缺乏傳統(tǒng)藥物結(jié)合口袋的“無結(jié)構(gòu)”蛋白特性，在其被發(fā)現(xiàn)的 40 年以來，尚無直接靶向 Myc 的藥物獲批上市。

近期，深圳灣實(shí)驗(yàn)室沈衛(wèi)軍團(tuán)隊(duì)開發(fā)了首個(gè)基于 Myc-NanoLuc 融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高通量篩選體系，用于篩選可下調(diào) Myc 的小分子化合物，并從 ChemDiv 多樣性化合物庫中篩選出能夠選擇性降解 Myc 蛋白的化合物 C1。

C1 對高表達(dá) Myc 的癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性，而對低表達(dá) Myc 的癌細(xì)胞影響較小，且能選擇性下調(diào)多種 Myc 靶基因 的表達(dá)。值得一提的是在研究過程中，團(tuán)隊(duì)使用了 TargetMol 的產(chǎn)品 EOAI3402143（G9）噢，大佬的選擇，值得信賴！

構(gòu)建并驗(yàn)證靶點(diǎn)-NanoLuc融合蛋白的HTS平臺(tái)
研究團(tuán)隊(duì)先是構(gòu)建了將 Myc 蛋白 與高穩(wěn)定性的 NanoLuc 熒光素酶 融合的質(zhì)粒，建立了首個(gè)基于 Myc-NanoLuc 融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高通量篩選體系，用于篩選可下調(diào) Myc 的小分子化合物。隨后利用包含17,452 種具有明確生物功能的生物活性化合物庫作為測試對象，成功鑒定出兩種與癌癥相關(guān)的臨床前小分子抑制劑：

• EOAI3402143（G9）：一種 去泛素化酶（DUB）抑制劑；
• SY-1365：一種 CDK7 抑制劑，同時(shí)抑制 CDK9 激酶活性。

它們均可促進(jìn) Myc 蛋白降解，驗(yàn)證了該篩選體系的有效性。

▲高通量篩選示意圖

C1選擇性殺傷Myc高表達(dá)腫瘤細(xì)胞
利用這一新構(gòu)建的平臺(tái)，研究團(tuán)隊(duì)接下來從 Chemdiv 化合物庫 中進(jìn)行了大規(guī)模篩選（包含108,800個(gè)化合物），經(jīng)過多輪驗(yàn)證，最終確定了 14種能夠顯著降低內(nèi)源性 Myc 蛋白水平的新型小分子化合物，并將這14種化合物被命名為 C1–C14。

接下來，團(tuán)隊(duì)采用了 CETSA（cellular thermal shift assay，細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)）來檢測 Myc 與 14 個(gè)候選化合物之間的相互作用。結(jié)果表明，化合物 C1、C3、C7、C8 和 C11 能夠像已知的 Myc 結(jié)合劑 MYC361i 一樣，在加熱條件下顯著穩(wěn)定細(xì)胞裂解液中的內(nèi)源性 Myc 蛋白。而其余 9 種化合物則未表現(xiàn)出明顯的穩(wěn)定作用。
 

▲14 種新型小分子化合物

通過對這5種化合物的多層驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了 C1 能夠在細(xì)胞水平上 選擇性降解內(nèi)源性 Myc 蛋白及其功能伴侶 Max 蛋白，其降解半效濃度（DC₅₀）約為 5 μM，并對其他蛋白幾乎無影響。

• 在無標(biāo)記定量質(zhì)譜（LFQ）分析中，C1 僅下調(diào)了 269 種蛋白，明顯少于其他候選化合物（C7、C8、G9 等），顯示出更好的 特異性。
• GO 富集分析結(jié)果顯示，C1 顯著影響了與 蛋白降解相關(guān)的生物過程，支持其通過促進(jìn)蛋白降解機(jī)制抑制 Myc 的作用模式。此外，C1 并不抑制 MYC mRNA 的表達(dá)，相反，處理后 MYC 轉(zhuǎn)錄水平略有上升，進(jìn)一步證明其作用靶點(diǎn)在蛋白層面而非轉(zhuǎn)錄水平。
• 在功能驗(yàn)證中，C1 對高 Myc 表達(dá)的癌細(xì)胞（如 Ramos、HCT116、K562）具有明顯的 選擇性殺傷效應(yīng)，GI₅₀ 值與 Myc 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；同時(shí)，C1 能 選擇性下調(diào) Myc 靶基因（如 CAD、CCNB1、CDK4、TERT、UBE2C）的表達(dá)，而對非靶基因（如ACTB、HPRT1）無影響。

▲C1 在較低劑量下優(yōu)先殺死高 Myc 表達(dá)的癌細(xì)胞，并選擇性地降低 Myc 靶基因表達(dá)。

以上結(jié)果表明，C1 是一種新型、且特異性強(qiáng)的小分子 Myc 降解劑，能夠通過促進(jìn) Myc/Max 復(fù)合體降解，選擇性抑制 Myc 依賴性癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)錄活性，具有潛在的抗腫瘤藥物開發(fā)價(jià)值。

C1作用機(jī)制
研究者此前已通過 CETSA 分析確認(rèn) C1 可與 Myc 結(jié)合，為探究C1的作用機(jī)制，研究者構(gòu)建了 Flag-Myc（f-Myc）質(zhì)粒，并在不同劑量的 C1 處理下進(jìn)行 f-Myc 共免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)，以檢測常見的 Myc E3 泛素連接酶（如 FBXW7、CHIP/STUB1）是否可被 f-Myc 拉下形成三元復(fù)合物。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1能以濃度依賴的方式誘導(dǎo)c-Myc蛋白發(fā)生自聚集，這種自聚集效應(yīng)伴隨著c-Myc/Max異源二聚體的解離。

既往研究表明，Myc/Max 二聚體的解離會(huì)使兩者失去穩(wěn)定性，并通過蛋白酶體途徑被降解。因此，研究者利用蛋白酶體抑制劑 MG132 來驗(yàn)證該途徑是否參與了 C1 誘導(dǎo)的 Myc 降解。發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑 MG132 不僅阻止了 DUB 抑制劑 G9 引起的 Myc 降解，也恢復(fù)了 C1 介導(dǎo)的 Myc 蛋白水平（見圖5C），說明蛋白酶體途徑參與了 C1 的 Myc 降解機(jī)制。

▲C1 充當(dāng)分子膠，聚集 Myc 蛋白，阻斷 Myc/Max 相互作用，并導(dǎo)致 Myc/Max 蛋白降解

以上結(jié)果表明，C1 是一種新型、非典型的 Myc 分子膠降解劑（MGD），能夠直接結(jié)合 Myc 蛋白并誘導(dǎo)其自聚集，從而阻斷 Myc/Max 相互作用，同時(shí)通過蛋白酶體（并可能輔以自噬途徑）促進(jìn) Myc 和 Max 的降解。該作用機(jī)制通過 Co-IP、熒光顯微以及熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，顯示出 C1 獨(dú)特的 Myc 聚集型降解特性，與其他 Myc 降解化合物不同，代表了一種全新的 Myc 靶向策略。

小結(jié)
綜上，該團(tuán)隊(duì)通過開發(fā) Myc-NanoLuc 融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞高通量篩選（HTS）體系，成功鑒定出能夠下調(diào) Myc 癌蛋白的小分子，其中 14 個(gè)初篩命中物表現(xiàn)出真實(shí)的 Myc 下調(diào)活性。

C1 是其中最突出的化合物，它不僅能結(jié)合并降解 Myc 蛋白，還能破壞 Myc/Max 相互作用并誘導(dǎo) Myc 聚集，加速其清除，從而成為一種特異性的 Myc 降解劑。C1 的機(jī)制可能屬于非典型的分子膠，類似于通過促進(jìn)靶蛋白聚集來誘導(dǎo)降解的 BI-3802；其作用可能涉及蛋白酶體和自噬途徑，但具體參與的 E3 泛素連接酶及分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

C1 及其他候選化合物（如 C7、C8）具有一定的脫靶效應(yīng)，且 C1 含有反應(yīng)性硝基，但分子量較低（337.3 Da），顯示出未來藥物化學(xué)優(yōu)化的潛力�？傮w而言，該研究展示了一種新的 HTS 策略用于發(fā)現(xiàn) Myc 靶向小分子，并初步揭示了 C1 作為非典型 Myc 分子膠降解劑的潛力，為進(jìn)一步臨床開發(fā)提供了基礎(chǔ)。