外泌體鑒定過程中WB實驗的注意事項和結果判斷

外泌體（Exosomes），一種40-160nm的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），來源于多囊泡體（MVB）。多囊泡體與質膜融合后，外泌體被釋放到細胞外。外泌體運輸蛋白質、脂質、核酸和糖，在細胞間通訊中發揮重要作用。
 
自2013年外泌體領域科學家獲得諾貝爾生理或醫學獎，外泌體在各個領域的作用都被深入研究。癌癥、心血管、免疫學、體外診斷，隨處可見外泌體身影，它在美容行業的應用也不可小覷。

小優給大家推薦過許多外泌體提取方法和試劑、外泌體miRNA知識。想必超速離心、密度梯度離心、沉淀法、膜親和法、免疫磁珠、分子排阻、超濾這些提取方法大家都十分了解。

這次來講一下外泌體的鑒定過程中，WB實驗的注意事項和結果判斷吧。

我們知道，外泌體表面蛋白包括四萜類、整合素、免疫調節蛋白等，CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神經酰胺等常用作外泌體標記的蛋白質。不過，在不同細胞中，它們的含量和表現也不盡相同。那么，在實際的實驗中，它們的結果都是怎樣的呢？
 
Tsg101
Tsg101最初作為腫瘤抑制因子和負生長調節劑被研究者發現，是轉運所需的內體分選復合體（ESCRT-I）的關鍵成分，參與多囊泡體的生物發生、外泌體分泌。因此被定為外泌體的標志物之一。
CD9、CD63和CD81
CD9、CD63和CD81屬于四萜類化合物，其特征是四個跨膜結構域和兩個細胞外結構域中最大的一個結構域中的特定折疊。所有細胞類型和組織都表達四萜蛋白的可變組合，其中一些主要存在于質膜上，如CD9；有些則存在于細胞內，如CD63。這類蛋白被認為是外泌體的特異性標記。然而，有文獻報道，這些蛋白質現在也已在凋亡小體和微泡中觀察到。

研究人員用MCF細胞做了實驗，分析了它們在EVs中的相對富集，即它們在EVs中相對于其細胞表達水平的比例。CD63的富集度比CD9低3倍，CD81的富集度平均比CD9高約2倍。與CD63相比，CD9和CD81主要定位在質膜上，細胞內定位很少。
Calnexin
Calnexin是一種I型整合內質網膜蛋白，通常位于內質網和胞質溶膠之間。Calnexin陰性被看作獲得較純的外泌體的條件之一。

我們經常會看到這樣的報道。CD63和CD81在OM-MSC外泌體中組成性表達，并且在外泌體部分中更豐富。在OM MSC衍生的外泌體中未檢測到陰性外泌體標記物calnexin。
但也有例外。
WB結果顯示，外泌體標記蛋白CD63和TSGl01在EMS（子宮內膜異位癥）外泌體和NHS（正常人樣本）外泌體中均大量表達。在NHS外泌體中未檢測到陰性標記蛋白Calnexin。在EMS外泌體中檢測到少量Calnexin。而我們可以看到，CD63在不同樣本中條帶位置也有細微的差異。
GM130
GM130是一種高爾基體骨架蛋白，與高爾基體膜緊密結合。研究者提取MSC外泌體，發現ALIX和CD63存在于EM中。而細胞色素c、GM130和calnexin在細胞裂解物中得到證實，但在EM中沒有。

 

以上就是用WB鑒定外泌體中最常檢測的指標了，大家可要注意下面這些點呀。

01 選擇合適的陰陽標志物作為對照
例如：檢測Tsg101、CD9、CD63、CD81其中2-3個；Calnexin、GM130其中1個，確定外泌體的濃度和純度。

02 與全細胞裂解物做對比
Tsg101、CD9、CD63、CD81這些蛋白也存在于其它細胞膜或細胞質，但與外泌體中的含量有差異。通過對比，不僅可以鑒定外泌體，也可以發現這些指標在發生病變的細胞中的變化。

03 條帶位置判斷
對比發現，即使來源相同細胞的細胞器和外泌體，檢測到的Tsg101、CD63等指標的表觀分子量也有所不同。尤其對于CD9、CD63、CD81這些膜蛋白，要放多裁一點膜來觀察它們是否發生糖基化條帶上移。

參考文獻：
María Yáñez-Mó，Pia R.-M. Siljander，Zoraida Andreu et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles（2015）4：27066.
Raghu Kalluri， Valerie S. LeBleu. The biology, function, and biomedical applications of exosomes (2020) 367(6478): eaau6977.

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