免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的主要步驟和避免IGG的方法

文章來(lái)源公眾號(hào)：生物隨筆          作者：陳

一、蛋白與抗體孵育
1、對(duì)于一個(gè)六孔板的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞密度加入約220-250 μL 的IP裂解液，冰上裂解10min。隨后12000 rpm，4℃離心 15 min 后吸取上清蛋白液；
2、取 20-50 μL蛋白液進(jìn)行 BCA 定量。根據(jù)蛋白的濃度吸取一定體積的蛋白液加入適量體積的目標(biāo)一抗（一抗比例根據(jù)說(shuō)明書(shū)，或者蛋白量：抗體=100 ug：1 ul）。BCA 定量剩下的蛋白液作為input樣品置于-20℃保存；
3、同時(shí)平行設(shè)置IgG對(duì)照組，加入適量體積的的IgG抗體。將實(shí)驗(yàn)組和IgG組含有抗體的蛋白液放置于4℃搖床孵育過(guò)夜；

二、磁珠吸附（第二天）
1、充分重懸管中磁珠；
2、取 40-50 μL  Protein A/G 磁珠轉(zhuǎn)移到 1.5 mL EP 管中；
3、加入約 0.5 ml 洗滌緩沖液，充分重懸磁珠。將 EP 管放入磁力架上，磁性分離。棄上清液。重復(fù)此步驟 2 次。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)加入適量洗滌緩沖液重懸。
4、向4℃搖床孵育過(guò)夜的蛋白-抗體復(fù)合物中，每管加入相當(dāng)于40-50 uL原液的Protein A/G Beads 溶液，輕度渦旋混勻放置于4℃搖床，緩慢結(jié)合 4h;。

若ProteinA/G 與 Beads 結(jié)合導(dǎo)致背景高；使用前使用 1～5% 的 BSA 進(jìn)行預(yù)封閉磁珠、免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和鹽離子濃度

三、蛋白變性洗脫
1、當(dāng)?shù)鞍?抗體復(fù)合物和磁珠孵育結(jié)束后，輕甩離心后置于磁力架進(jìn)行磁性分離，去上清；
2、加入1mL 洗滌緩沖液 清洗beads，共5次；
3、當(dāng)完成最后一次洗滌后，棄去洗滌液加入適當(dāng)體積（約40ul）的 1xloading。 1xloading用IP裂解液稀釋并加入蛋白酶抑制劑。加入loading后，將蛋白樣品通過(guò)金屬浴加熱變性即得蛋白樣本，使用磁力架或者離心分離棄去磁珠。后續(xù)通過(guò)免疫印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

#洗滌緩沖液：PBST: 1*PBS +0.5%Tween-20 即50ml PBS + 250μl Tween-20

​四、如何避免IGG
IGG一般有兩條，分別是25和55kDa的輕鏈和重鏈，如果這個(gè)位置恰好在我們的目的條帶附近就會(huì)產(chǎn)生干擾。那么如何避免這兩條干擾條帶呢？

如果是外源性蛋白，目標(biāo)蛋白上一般會(huì)有標(biāo)簽如Flag這些，那么就可以在免疫沉淀的時(shí)候加入如兔源的Flag抗體，洗脫完WB跑完孵育抗體顯影時(shí)，可以用鼠源的Flag抗體，那么對(duì)應(yīng)的二抗就是抗鼠的二抗。此時(shí)抗鼠的二抗一般就不會(huì)識(shí)別免疫沉淀時(shí)加入的兔源的Flag抗體。因而就不會(huì)產(chǎn)生IGG條帶。不過(guò)在實(shí)際過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，即便是這樣也會(huì)出現(xiàn)顯影出IGG的輕鏈或者重鏈。也就是這種方法只能規(guī)避掉其中一條鏈，此時(shí)就可以使用特異性識(shí)別輕鏈或者重鏈的專用二抗來(lái)徹底避免IGG條帶。這種方法適用于實(shí)驗(yàn)室有不同種屬抗體，尤其是標(biāo)簽抗體比較便宜可以實(shí)現(xiàn)。如果僅僅想避免輕重鏈其中一條帶，直接使用特異性識(shí)別輕鏈或者重鏈的專用二抗即可。這種方法適用于標(biāo)簽抗體，因?yàn)闃?biāo)簽抗體還是比較便宜的，所以買兩個(gè)不同種屬的標(biāo)簽抗體還是可以接受的。

如果是內(nèi)源性蛋白，要買兩個(gè)不同種屬的抗體可能比較貴。那么要么用特異性識(shí)別輕鏈或者重鏈的專用二抗來(lái)避免其中的一條帶。要么購(gòu)買能識(shí)別空間構(gòu)象的IP專用二抗。因?yàn)樵贗P免疫沉淀時(shí)加入的抗體，在洗脫后會(huì)經(jīng)過(guò)煮蛋白的過(guò)程，此時(shí)加進(jìn)入的抗體會(huì)產(chǎn)生空間構(gòu)象的改變。而后面WB加入的抗體因?yàn)槭钦�常的結(jié)構(gòu)，所以可以利用這點(diǎn)采取識(shí)別兩種不同構(gòu)象的二抗。但這種二抗實(shí)際使用效果可能并不是很好，有些反映還是會(huì)有IGG條帶。雖然條帶可能會(huì)變淡，目的條帶也有可能變淡。