小分子蛋白WB檢測(cè)技巧及獲得理想條帶的辦法

瀏覽次數(shù)：526　發(fā)布日期：2025-9-28　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一直以來，凋亡、自噬、炎癥等相關(guān)通路都是科研者們研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，在這些通路的研究中，Cleaved-Caspase 3、Bax、Bcl-2、LC3B、IL-6、TNFα等小分子量蛋白作為標(biāo)志性角色，更是科研實(shí)驗(yàn)中必不可少的研究對(duì)象。然而小分子蛋白的WB檢測(cè)總是容易出現(xiàn)各種各樣的問題：分離效果差，條帶拖尾模糊，無條帶等，無一不是大家科研路上的絆腳石，有時(shí)嘗試各種優(yōu)化調(diào)整甚至更換樣本和抗體仍不能獲得理想的結(jié)果。今天，小優(yōu)細(xì)節(jié)君就來和大家聊一聊獲得小分子蛋白理想條帶有什么好的辦法。

在進(jìn)行小分子蛋白WB實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們經(jīng)常忽略的電泳步驟，可能是條帶好壞的關(guān)鍵影響因素。目前最常用的Tris-Glycine-SDS-PAGE凝膠電泳體系，原理是讓蛋白與SDS結(jié)合，蛋白帶上大量負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下向前遷移。根據(jù)蛋白質(zhì)通過凝膠孔的時(shí)間，將不同分子量大小的蛋白分離開來。而小分子蛋白在電泳時(shí)形成的復(fù)合物的大小和電荷與SDS微團(tuán)相近，很難被分離出來[1]，導(dǎo)致結(jié)果條帶模糊或無條帶，那我們可以怎么做來改善這一情況呢？

凝膠體系
有研究者提出可以減少電泳中SDS的用量，但效果并不佳。Schagger[1]等提出可以在高離子強(qiáng)度下電泳來實(shí)現(xiàn)更好的分離效果，他們用三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine）代替甘氨酸（Gly），形成了一種新的Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳體系。與Gly（pK 9.6）相比，Tricine（pK 8.15）在pH為6.8~8.8時(shí)，更多以陰離子形式存在，在膠中的遷移速度更快，能夠顯著提高對(duì)小分子蛋白的分離效果。用兩種體系對(duì)相同樣本進(jìn)行檢測(cè)，Tricine-SDS-PAGE能夠有效分離17.2-2.5kDa的蛋白（Fig.1a），而相同實(shí)驗(yàn)步驟下，Glycine-SDS-PAGE體系分離效果較差，條帶并未被分離（Fig.1 b）。

Fig.1 不同體系分離蛋白對(duì)比圖

與常規(guī)的體系相比，Tricine-SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)一般需要使用2種不同的緩沖液：陽極緩沖液和陰極緩沖液，陰極緩沖液中用Tricine代替Glycine。電泳時(shí)在電泳槽底部加入陽極緩沖液，兩塊膠的中間槽加入陰極緩沖液，實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子蛋白更有效的分離。

凝膠濃度
凝膠濃度決定孔徑，孔徑是影響蛋白在電場(chǎng)中遷移速度的重要影響因素。凝膠的孔徑越小，小分子蛋白在其中遷移的速度越慢，分辨效果也越好。

分離膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的比例會(huì)影響凝膠的孔徑大小。在Tricine-SDS-PAGE體系中，通過對(duì)比凝膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的不同比例和交聯(lián)度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過改進(jìn)的比例較原先的分離效果更好，可以更精細(xì)地分辨1-100kDa之間的蛋白[2]。如Fig.2a、b、c，改變凝膠中兩種單體的百分比和交聯(lián)度對(duì)于同一樣品的分離效率不同。

在分離膠中添加尿素也可以提高膠的分離效果。尿素可以改變凝膠的結(jié)構(gòu)，降低凝膠孔徑的大小。在分離膠中添加一定比例的尿素，可以增強(qiáng)對(duì)小分子蛋白的分離效果[3，4]（Fig.2d）。另有一些研究發(fā)現(xiàn)在分離膠中添加甘油也可以起到與尿素一樣的效果[5]。

Fig.2 Tricine-SDS-PAGE不同凝膠配比結(jié)果對(duì)比圖

(a)10% T, 3% C (b)16% T, 3% C (c)16% T, 6% C (d)16% T, 6% C plus 6M urea

T: 兩種單體的總百分比濃度. C: 交聯(lián)劑的濃度

電泳條件
在電泳時(shí)控制跑膠時(shí)間，保證小分子蛋白與內(nèi)參分開，盡量不要跑太久，前沿接近膠底部即可。嘗試用恒流進(jìn)行電泳，濃縮膠推薦30mA，分離膠推薦45mA。
電泳過程中注意降溫，溫度升高會(huì)加快小蛋白分子的運(yùn)動(dòng)，增加彌散速度。

轉(zhuǎn)膜條件
可以適當(dāng)減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間，降低轉(zhuǎn)膜的電壓電流，防止過轉(zhuǎn)。同時(shí)在轉(zhuǎn)膜后可以用麗春紅染色確保轉(zhuǎn)膜成功。建議使用0.22μm孔徑的膜，且可以將膜在甲醇中激活的時(shí)間延長(zhǎng)至2~3min，增加膜與蛋白的結(jié)合率。

其他小細(xì)節(jié)
（1）確定樣本中靶標(biāo)蛋白的表達(dá)量，可以通過The Human Protein Atlas、GeneCards、BioGPS等數(shù)據(jù)庫(kù)查詢。很多小分子蛋白需要適當(dāng)刺激才能誘導(dǎo)表達(dá)，所以實(shí)驗(yàn)前要做好充分的文獻(xiàn)調(diào)研。
（2）在樣本制備過程中添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解；在制樣過程中增加超聲處理，盡可能的充分裂解樣品，暴露抗原表位。盡量使用新鮮樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（3）小分子蛋白由于彌散拖尾現(xiàn)象較多，最好是保留3個(gè)以上marker，或者做全膜，避免蛋白被裁去。

推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：

產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱
13070	Color-coded Prestained Protein Marker, Low Range (1.7-42 kDa)
abs9511	藍(lán)色預(yù)染蛋白 Marker (3.3-31kDa)
abs9303	預(yù)制膠（15%，10wells）
abs9310	預(yù)制膠（15%，15wells）
abs9306	預(yù)制膠（8-20%，10wells）
abs9329	3-5kDa小分子量預(yù)制膠（16.5%，15wells）
abs9328	3-5kDa小分子量預(yù)制膠（16.5%，10wells）
abs9512	3-5kDa小分子量預(yù)制膠試劑盒（16.5%，10wells）
abs9513	3-5kDa小分子量預(yù)制膠試劑盒（16.5%，15wells）
abs9509	Tris-Tricine陽極緩沖液（5×）
abs9510	Tris-Tricine陰極緩沖液（5×）
abs9508	小分子蛋白上樣緩沖液（2×）
abs931	PVDF膜（0.22μm）
abs9255	麗春紅S染色液

參考文獻(xiàn)：
[1] Schägger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987 Nov 1;166(2):368-79. doi: 10.1016/0003-2697(87)90587-2. PMID: 2449095
[2] 曹佐武.有效分離1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2004(01): 74-76. DOI:10.13523/j.cb.20040118.
[3] Schägger H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 2006;1(1): 16-22.doi: 10.1038/nprot.2006.4. PMID: 17406207
[4] 詹玉春,劉文斌.用SDS-PAGE電泳測(cè)定豆粕酶解物中的低分子多肽分子量[J].畜牧與獸醫(yī), 2004(11): 4-6.
[5] 江龍法,錢志剛,楊海麟等.用于分離小分子肽的凝膠電泳的改進(jìn)研究[J].化學(xué)世界, 2007(04): 200-202. DOI: 10.19500/j.cnki.0367-6358.2007.04.003.

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