mTOR的信號通路及WB檢測和磷酸化時常見問題及解決方法
mTOR全稱為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin），是PI3K相關激酶家族中的一種絲氨酸蛋白激酶。在真核細胞中，mTOR可以通過感知和整合生長因子、能量狀態(tài)和營養(yǎng)水平等外部信息，調節(jié)細胞生長發(fā)育和細胞自噬等重要生命過程[1]。mTOR信號通路的功能障礙可以引起多種疾病，包括肥胖和糖尿病，甚至腫瘤[2]。mTOR信號通路是一個非常經(jīng)典的熱門靶點，那么今天小優(yōu)細節(jié)君就帶大家一起了解一下這個蛋白。
mTOR可以形成兩種不同的復合物mTORC1和mTORC2，來行使不同的功能[3]。mTORC1和mTORC2的差異請見下圖：
mTORC1主要響應營養(yǎng)、能量和生長因子等信號，通過磷酸化下游效應子來促進蛋白質、脂質、核苷酸和葡萄糖的合成，抑制蛋白質的分解。主要下游效應子有S6K1、4E-BP1、ULK1，還有多種轉錄因子，從而發(fā)揮不同的功能。
mTORC2主要充當胰島素/PI3K信號通路的效應子，功能雖少，但是非常重要。同時也受mTORC1的負反饋回路調節(jié)[5]。
如果各位小伙伴不知道要研究下游哪個蛋白，可以參考下圖。
通過前面的介紹，相信大家對mTOR的結構和功能有一定的了解，接下來小優(yōu)細節(jié)君就和大家一起探討一下關于WB檢測中mTOR和磷酸化mTOR經(jīng)常遇見無信號的情況，該如何解決。
01 首先需要了解所使用樣本的表達量情況。
雖然說mTOR是個生長和代謝重要的蛋白，幾乎在所有組織中都有表達，但是組織間也是有明顯高低差異的，如果忽略了這點，可能就會出現(xiàn)無條帶或者弱條帶的情況。我們可以通過查閱數(shù)據(jù)庫如The Human Protein Altas，BioGPS，Depmap等去查看樣本表達的高低。如下圖，脂肪組織，平滑肌組織，淋巴結組織就未檢測到蛋白表達。
如果樣本表達較少可以通過增加上樣量，組織樣本上樣50ug以上，細胞樣本上樣20ug以上，加上充分裂解樣本（超聲處理）。同時也可以通過增加陽性對照樣本來排查問題。
Tips：樣本如何超聲，使用超聲頻率是30%-40%的超聲儀，冰浴超聲5s*3次; 如果沒有超聲儀，可以用1ml 帶針頭注的射器冰上反復抽吸至無阻力。
02 排除WB實驗步驟問題，尤其是轉膜步驟。
由于mTOR蛋白分子量達到289KDa，大分子量WB從來不是一件容易的事情，我們需要額外注意一些細節(jié)：
❖Marker：更換大分子量marker，方便判斷條帶位置。
❖電泳：是否選擇合適的膠，電泳時間是否足夠蛋白跑下來。我們建議使用6%的膠，電泳時間延長至1.5-2h。
❖轉膜：轉膜液甲醇濃度，轉膜電流，時間和溫度是否合適。我們推薦降低轉膜液中的甲醇濃度，5-10%，可以額外添加0.1%SDS幫助蛋白轉移。轉膜選擇恒流轉，200-250mA，時間3-4h，轉膜期間務必保持低溫。
03 如果total mTOR沒問題，p-mTOR無條帶，我們還需要判斷對樣本的刺激方式是否合適，是否成功誘導磷酸化。
1) 從PSP數(shù)據(jù)庫中，我們可以查到常用的刺激物是什么。括號里的數(shù)字為參考文獻，可以點擊具體查看。
如果刺激物沒問題，我們還需要進一步做一下濃度和時間的梯度，來確定最佳的實驗條件。
2) 我們可以參考廠家官網(wǎng)上查看質檢所用的樣本是如何刺激處理的。
3) 制樣時必須加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，防止磷酸化蛋白降解。也可以檢測相關的上下游磷酸化蛋白以佐證實驗步驟正常。
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產品名稱 |
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Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody(S2481) |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody |
參考文獻：
[1] Mardanshahi, A., N.A. Gharibkandi, S. Vaseghi, et al. The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors enhance radiosensitivity in cancer cell lines[J]. Molecular Biology Reports, 2021, 48(8): p. 1-14.
[2] Harrington LS, et al. The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K signaling via regulation of IRS proteins. J Cell Biol. 2004;166(2):213–223.
[3] Wang L, Rhodes CJ, Lawrence JC., Jr Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) by insulin is associated with stimulation of 4EBP1 binding to dimeric mTOR complex 1. J Biol Chem. 2006;281:24293–24303.
[4] Saxton RA, Sabatini DM. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 2017;168:960–976.
[5] Popova NV, Jücker M. The role of mTOR signaling as a therapeutic target in cancer[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(4).
