P-STAT1的序列、激活機制及做出理想WB條帶的方法
STATs，全稱信號轉導和轉錄激活蛋白（Signal transducer and activator of transcription proteins），既是細胞質中的信號轉導子，又是細胞核中的轉錄激活子。目前，已知有七種類型的STAT蛋白。它們參與不同的生物學過程，如免疫、細胞分裂、細胞死亡和腫瘤形成。STAT1是細胞對干擾素（IFN）反應的主要介質。研究者破壞細胞和小鼠的STAT1基因后，觀察到它們對IFN的刺激不再反應，而對其它細胞因子的仍舊保持反應，以此判斷STAT1對IFN途徑具有特異性。它通過在細胞核中轉導I型IFN（IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω）、II型IFNγ和III型IFNλ的信號，在對抗病毒和分枝桿菌的免疫反應中發揮關鍵作用。
STAT1由六個不同的區域組成：
（1）螺旋N-末端結構域（ND），它對DNA上相鄰STAT二聚體之間的相互作用很重要；
（2）與調節蛋白相互作用的卷曲線圈（CC）結構域；
（3）用于識別靶基因的特異性DNA序列的DNA結合域（DBD）；
（4）參與核輸出和DNA結合的螺旋連接體（LK）結構域；
（5）用于受體結合和二聚化的Src同源性2（SH2）結構域；
（6）C末端反式激活結構域（TAD），其包含在轉錄激活時被磷酸化的特定殘基。
STAT1與STAT家族成員的激活方式相似，都是通過一類與IFN受體相關的非受體酪氨酸激酶Janus激酶（JAKs和TYK2）在細胞質內的酪氨酸磷酸化而被激活。IFN刺激后，磷酸化STAT1分子通過pTyr701-SH2相互作用二聚化。STAT1二聚體向細胞核轉移，在細胞核中它們激活基因轉錄。
STAT1的激活需要Y701和S727的磷酸化以及氨基末端精氨酸的甲基化。STAT1精氨酸甲基化的抑制或STAT1 Arg-31的突變導致STAT1酪氨酸磷酸化的半衰期延長，所以大家在研究STAT1功能的時候一般要先檢測Y701和S727的磷酸化。多種細胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、PDGF和EGF都可以刺激這兩個位點的磷酸化。例如，EGF處理后，JAK1、JAK2或TYK2刺激Tyr-701的磷酸化促進二聚化和隨后向細胞核的易位。MAPK14、ERK1/2、CAMK2/CAMKII和CK2在內的幾種激酶對Ser-727的磷酸化尤為重要。
我們在檢測p-STAT1，尤其是p-STAT1（Tyr701）的時候，沒有信號或者條帶不好看，應該怎么辦呢？
1、檢測Total STAT1
雖然STAT1分布非常廣泛，在各種組織和細胞中都有表達，但是相對表達量仍然有高低之分，下圖可以看到，相同的上樣量，在HEK-293T細胞中檢測到的STAT1非常弱。如果STAT1大部分在核內，樣本提取的難度增加。STAT1有兩種由其轉錄物的選擇性剪接產生的亞型：STAT1α（91kDa）和STAT1β（84kDa）。STAT1α由750個氨基酸組成，是STAT1的主要形式。STAT1β是一種短型，由712個氨基酸組成。STAT1α在位于TAD的酪氨酸701（Y701）和絲氨酸727（S727）殘基上有兩個磷酸化位點，而STAT1β缺乏部分TAD，僅包含Y701磷酸化位點。從total STAT1著手，先確定樣本中是否可以同時檢測到STAT1α和STAT1β，確認了研究對象以后才能應用正確的模型和方法。
圖3 STAT1在不同細胞的表達情況：1. HeLa細胞；2. HEK-293T；3. MCF7。上樣量20ug/孔
2、選擇合適的取樣時間
有研究表明，在IFN-β處理的細胞中，10分鐘和30分鐘內，STAT1在Tyr-701和Ser-727處磷酸化。相反，STAT1 Ser-708磷酸化在16小時后首次被檢測到，并在24小時后達到峰值，Tyr-701磷酸化已經大幅遞減。這可能是由于Ser-708磷酸化需要Tyr-701的去磷酸化和CRM1介導的STAT1入核。研究者也分別用IFN-γ、IFN-λ處理細胞，隨著時間的推移， STAT1磷酸化水平呈現不同的變化。
當檢測的磷酸化位點不同時，應用不同的藥物，應設置不同的取樣時間，最好是短時間內多次取樣。
3、樣本提取方法
分布于細胞核內的STAT1要怎樣檢測更方便呢？除了使用裂解能力較強的RIPA，制備樣本時超聲處理是很好的選擇。超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒有超聲儀，可以用1ml 帶針頭注的射器冰上反復抽吸10-15 次，直到裂解液澄清好吸為止。或者使用試劑盒提取胞核部分進行檢測。
參考文獻：
1. Manlio Tolomeo， Andrea Cavalli， Antonio Cascio. STAT1 and Its Crucial Role in the Control of Viral Infections. Int. J. Mol. Sci. （2022）23: 4095.
2. J E Durbin 1，R Hackenmiller，M C Simon，et al. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. (1996)84: 443-450.
3. Olivia Perwitasari, Hyelim Cho, Michael S，et al. Inhibitor of κB Kinase ε (IKKε), STAT1, and IFIT2 Proteins Define Novel Innate Immune Effector Pathway against West Nile Virus Infection. （2011）286(52): 44412–44423
部分相關產品：
STAT1由六個不同的區域組成：
（1）螺旋N-末端結構域（ND），它對DNA上相鄰STAT二聚體之間的相互作用很重要；
（2）與調節蛋白相互作用的卷曲線圈（CC）結構域；
（3）用于識別靶基因的特異性DNA序列的DNA結合域（DBD）；
（4）參與核輸出和DNA結合的螺旋連接體（LK）結構域；
（5）用于受體結合和二聚化的Src同源性2（SH2）結構域；
（6）C末端反式激活結構域（TAD），其包含在轉錄激活時被磷酸化的特定殘基。
圖1 STAT1的序列
STAT1與STAT家族成員的激活方式相似，都是通過一類與IFN受體相關的非受體酪氨酸激酶Janus激酶（JAKs和TYK2）在細胞質內的酪氨酸磷酸化而被激活。IFN刺激后，磷酸化STAT1分子通過pTyr701-SH2相互作用二聚化。STAT1二聚體向細胞核轉移，在細胞核中它們激活基因轉錄。
圖2 STAT的激活
STAT1的激活需要Y701和S727的磷酸化以及氨基末端精氨酸的甲基化。STAT1精氨酸甲基化的抑制或STAT1 Arg-31的突變導致STAT1酪氨酸磷酸化的半衰期延長，所以大家在研究STAT1功能的時候一般要先檢測Y701和S727的磷酸化。多種細胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、PDGF和EGF都可以刺激這兩個位點的磷酸化。例如，EGF處理后，JAK1、JAK2或TYK2刺激Tyr-701的磷酸化促進二聚化和隨后向細胞核的易位。MAPK14、ERK1/2、CAMK2/CAMKII和CK2在內的幾種激酶對Ser-727的磷酸化尤為重要。
我們在檢測p-STAT1，尤其是p-STAT1（Tyr701）的時候，沒有信號或者條帶不好看，應該怎么辦呢？
1、檢測Total STAT1
雖然STAT1分布非常廣泛，在各種組織和細胞中都有表達，但是相對表達量仍然有高低之分，下圖可以看到，相同的上樣量，在HEK-293T細胞中檢測到的STAT1非常弱。如果STAT1大部分在核內，樣本提取的難度增加。STAT1有兩種由其轉錄物的選擇性剪接產生的亞型：STAT1α（91kDa）和STAT1β（84kDa）。STAT1α由750個氨基酸組成，是STAT1的主要形式。STAT1β是一種短型，由712個氨基酸組成。STAT1α在位于TAD的酪氨酸701（Y701）和絲氨酸727（S727）殘基上有兩個磷酸化位點，而STAT1β缺乏部分TAD，僅包含Y701磷酸化位點。從total STAT1著手，先確定樣本中是否可以同時檢測到STAT1α和STAT1β，確認了研究對象以后才能應用正確的模型和方法。
圖3 STAT1在不同細胞的表達情況：1. HeLa細胞；2. HEK-293T；3. MCF7。上樣量20ug/孔
圖4 HPA中STAT1表達水平，與上圖WB結果一致
2、選擇合適的取樣時間
有研究表明，在IFN-β處理的細胞中，10分鐘和30分鐘內，STAT1在Tyr-701和Ser-727處磷酸化。相反，STAT1 Ser-708磷酸化在16小時后首次被檢測到，并在24小時后達到峰值，Tyr-701磷酸化已經大幅遞減。這可能是由于Ser-708磷酸化需要Tyr-701的去磷酸化和CRM1介導的STAT1入核。研究者也分別用IFN-γ、IFN-λ處理細胞，隨著時間的推移， STAT1磷酸化水平呈現不同的變化。
當檢測的磷酸化位點不同時，應用不同的藥物，應設置不同的取樣時間，最好是短時間內多次取樣。
圖5 IFN-β處理的纖維肉瘤細胞中Stat1激活情況
3、樣本提取方法
分布于細胞核內的STAT1要怎樣檢測更方便呢？除了使用裂解能力較強的RIPA，制備樣本時超聲處理是很好的選擇。超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒有超聲儀，可以用1ml 帶針頭注的射器冰上反復抽吸10-15 次，直到裂解液澄清好吸為止。或者使用試劑盒提取胞核部分進行檢測。
參考文獻：
1. Manlio Tolomeo， Andrea Cavalli， Antonio Cascio. STAT1 and Its Crucial Role in the Control of Viral Infections. Int. J. Mol. Sci. （2022）23: 4095.
2. J E Durbin 1，R Hackenmiller，M C Simon，et al. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. (1996)84: 443-450.
3. Olivia Perwitasari, Hyelim Cho, Michael S，et al. Inhibitor of κB Kinase ε (IKKε), STAT1, and IFIT2 Proteins Define Novel Innate Immune Effector Pathway against West Nile Virus Infection. （2011）286(52): 44412–44423
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