TR‑FRET、THUNDER檢測(cè)技術(shù)在PROTAC藥物研發(fā)中的應(yīng)用
近年來，生物醫(yī)藥領(lǐng)域風(fēng)起云涌，一種名為PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）的新型藥物研發(fā)策略引起了廣泛關(guān)注，被譽(yù)為“顛覆傳統(tǒng)的小分子藥物模式”。那么，PROTAC究竟是什么？它與傳統(tǒng)藥物有何不同？目前處于什么樣的發(fā)展階段？本文將為你一一解讀。
一、PROTAC
PROTAC，全稱為“蛋白降解靶向嵌合體”，是一種基于細(xì)胞內(nèi)天然蛋白質(zhì)降解機(jī)制的創(chuàng)新型小分子藥物設(shè)計(jì)策略。
它的結(jié)構(gòu)由三個(gè)部分組成：
靶蛋白配體（warhead）：能夠選擇性結(jié)合目標(biāo)蛋白；
E3連接酶配體（ligand）：能結(jié)合泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的E3泛素連接酶；
連接臂（linker）：將兩者連接起來。
通過將這兩個(gè)配體連接在一起，PROTAC分子能將靶蛋白“送”到細(xì)胞的降解機(jī)器——泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）中去泛素化降解，從而在系統(tǒng)水平上調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。
圖：基于小分子的PROTAC示意圖
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
迄今為止，已有 30 多種對(duì)疾病發(fā)展至關(guān)重要的蛋白質(zhì)成為靶向，其中主要致力于癌癥治療的蛋白質(zhì)。靶向蛋白包括核受體（ER、AR 和 RAR）、蛋白激酶（Akt、BCR-Abl、c-Abl、BTK、ALK、CDK9、RIPK2、DAPK1 和 PSD-95）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（BRD4、Sirt2、HDAC6、TRIM24、IKZF1/3 和 Smad3）、調(diào)節(jié)蛋白（CRABP-I/II、TACC3、AHR、FKBP12、ERRα 和 X-protein）、神經(jīng)退行性相關(guān)蛋白（Huntingtin、Tau、α-synuclein和 PSD-95）、細(xì)胞代謝酶（MetAP-2 和 DHODH）、 和融合蛋白（Halo tags）。
圖：靶向蛋白、靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和E3泛素連接酶的總覽
From：Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):21-30. doi:10.1002/cbf.3369
二、PROTAC主要優(yōu)勢(shì)
傳統(tǒng)小分子藥物的模式是“占位”——它們與靶點(diǎn)結(jié)合，抑制其活性。但這通常只適用于“有活性位點(diǎn)”的蛋白，很多被稱為“不可成藥靶點(diǎn)”（undruggable targets）的蛋白，因?yàn)槿狈线m結(jié)合位點(diǎn)，難以被傳統(tǒng)藥物“拿下”。
而PROTAC則是“破壞”策略。它不需要永久結(jié)合目標(biāo)蛋白，僅需要暫時(shí)結(jié)合并引導(dǎo)其降解。一旦目標(biāo)蛋白被降解，PROTAC分子可以“游走”去招募下一個(gè)目標(biāo)。
那么，PROTAC的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)就有：
- 攻克“不可成藥靶點(diǎn)”：PROTAC可以降解那些難以抑制的蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)蛋白等。
- 持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、用量低：由于其可重復(fù)使用的機(jī)制，PROTAC往往具有更持久的藥效。
- 減少耐藥性：傳統(tǒng)抑制劑常因突變產(chǎn)生耐藥性，而PROTAC通過降解可減少這一問題。
- 選擇性更強(qiáng)：通過設(shè)計(jì)linker和配體結(jié)構(gòu)，PROTAC可以獲得更高的靶點(diǎn)選擇性。
三、PROTAC研發(fā)進(jìn)展
自PROTAC概念首次提出以來，技術(shù)不斷成熟。如今，全球已有多款PROTAC候選藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，靶點(diǎn)涵蓋癌癥、炎癥、自身免疫疾病等多個(gè)領(lǐng)域。
1．TRD209（SHP2靶向PROTAC降解劑）：
由北京泰德制藥研發(fā)，成功破解“不可成藥”的SHP2靶點(diǎn)，進(jìn)入藥物開發(fā)階段，對(duì)急性髓系白血病（AML）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）表現(xiàn)出開發(fā)潛力。
2．ARV‑471（雌激素受體降解劑）：
由 Arvinas與輝瑞合作開發(fā)，目前處于 III 期臨床研究，獲FDA快速通道資格，專注治療ER+/HER2−乳腺癌。
3．BMS‑986365（AR靶點(diǎn)）：
Celgene啟動(dòng)了 III 期臨床試驗(yàn)，針對(duì)去勢(shì)抵抗性轉(zhuǎn)移性前列腺癌（mCRPC），共有約 960例患者參與。
4．ARV‑102（LRRK2靶向降解劑）：
Arvinas發(fā)布首個(gè)人體臨床結(jié)果，在健康志愿者中安全耐受性良好，有效降低中樞與外周LRRK2水平，為神經(jīng)退行性疾病提供新的療法。
雖然前景廣闊，但PROTAC也面臨不少挑戰(zhàn)：
1. 分子量大、口服性差：PROTAC通常較大，影響口服生物利用度 。
2. 藥代動(dòng)力學(xué)復(fù)雜：在體內(nèi)的穩(wěn)定性、分布等仍需優(yōu)化 。
3. E3連接酶數(shù)量有限：目前常用的E3酶較少（如VHL、CRBN），限制靶點(diǎn)拓展。
4. 免疫原性與安全性：長(zhǎng)期降解特定蛋白可能影響正常生理過程 。
“分子膠（molecular glue）”等相關(guān)技術(shù)也在蓬勃發(fā)展，與PROTAC一起，共同推動(dòng)新一代“降解型藥物”平臺(tái)的興起。不可否認(rèn)的是，靶向蛋白降解已經(jīng)成為新藥研發(fā)最炙手可熱的方向之一，值得科研界與產(chǎn)業(yè)界持續(xù)關(guān)注。
四、TR‑FRET 技術(shù)在 PROTAC 研發(fā)中的應(yīng)用：
TR‑FRET（Time‑Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一種高靈敏的檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)PROTAC三元復(fù)合物結(jié)合。TR‑FRET 可一次性對(duì)PROTAC與靶蛋白、E3連接酶結(jié)合活性進(jìn)行評(píng)估，無需多個(gè)分開試驗(yàn)，在篩選效率和成本上具備優(yōu)勢(shì)。
TR‑FRET 技術(shù)應(yīng)用廣泛，可快速轉(zhuǎn)至其他靶標(biāo)（如不同 BRDs）而無需更改 assay 條件，具備良好的模塊化特性。
（一）PROTAC三元復(fù)合物結(jié)合
以GSPT1/CRBN三元結(jié)合為例
CC-885是一種新型的cereblon分子膠調(diào)節(jié)劑，它通過與cereblon (CRBN) 結(jié)合，利用CRL4CRBN E3泛素連接酶的功能，發(fā)揮抗腫瘤活性。其主要靶點(diǎn)是翻譯終止因子GSPT1，CC-885能夠促進(jìn)GSPT1的CRBN依賴性泛素化和降解，從而在患者來源的急性髓系白血病腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出高度敏感性，顯示出其臨床潛力。該實(shí)驗(yàn)用Europium-labeled Tag1和Acceptor-labeled Tag2檢測(cè)CRBN/DDB1蛋白和GSPT1蛋白通過分子膠CC-885介導(dǎo)的相互作用。
圖左CRBN與GSPT1檢測(cè)原理圖；圖右CC-885介導(dǎo)CRBN與GSPT1結(jié)合曲線
其他應(yīng)用實(shí)例包括 HDAC10 的 TR‑FRET 配體置換分析，可無需酶促底物，直接評(píng)估結(jié)合活性，為非傳統(tǒng)靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)路徑。
優(yōu)寧維提供HDAC10 ELISA檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：abs551208-96T），采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被有Histone deacetylase 10 （HDAC10）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，HRP 酶結(jié)合物，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB 在過氧化物酶（HRP）的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Histone deacetylase 10 （HDAC10）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。檢測(cè)范圍：78.1-5000pg/mL。
技術(shù)原理
THUNDER檢測(cè)是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與兩個(gè)蛋白結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合的蛋白濃度成正比，可直接監(jiān)測(cè)三元復(fù)合物形成，也便于測(cè)定結(jié)合動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。全程僅需1h，免洗，可高通量。檢測(cè)靈敏度高，上限寬。
使用Bioauxilium 提供的Toolbox試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的可能方案（如下圖），是蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)B之間的相互作用實(shí)驗(yàn) 的一些不同的實(shí)驗(yàn)組合。舉例說明，蛋白質(zhì)A帶有Tag-a標(biāo)簽，蛋白質(zhì)B可以是天然的（圖A），或者將蛋白質(zhì)B進(jìn)行生物素化（圖 B），或帶有Tag-b（圖C），或者將蛋白質(zhì)B直接進(jìn)行受體或供體標(biāo)記（圖D）。這幾種示例中，兩種蛋白的標(biāo)簽或標(biāo)記都可以互換使用。
圖：蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)B相互作用實(shí)驗(yàn)方案
圖A，使用帶有供體標(biāo)記的抗標(biāo)簽a抗體結(jié)合蛋白質(zhì)A，并使用帶有受體標(biāo)記的抗蛋白質(zhì)B抗體（定制或用用標(biāo)記試劑標(biāo)記）結(jié)合蛋白質(zhì)B，產(chǎn)生FRET信號(hào)。
圖B，使用帶有供體標(biāo)記的抗標(biāo)簽a抗體結(jié)合蛋白質(zhì)A，用受體標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合生物素化的蛋白質(zhì)B產(chǎn)生FRET信號(hào)。
圖C，使用帶有供體標(biāo)記的抗標(biāo)簽a抗體結(jié)合蛋白質(zhì)A，并使用帶有受體標(biāo)記的抗Tag-b抗體結(jié)合蛋白質(zhì)B，產(chǎn)生FRET信號(hào)。
圖D，使用帶有供體標(biāo)記的抗標(biāo)簽a抗體結(jié)合蛋白質(zhì)A，直接將蛋白質(zhì)B進(jìn)行受體標(biāo)記，產(chǎn)生FRET信號(hào)。
下游實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
PROTAC藥物研發(fā)下游實(shí)驗(yàn)涉及細(xì)胞因子、磷酸化蛋白的檢測(cè)，TR-FRET可以快速篩選潛在候選分子，助力科學(xué)實(shí)驗(yàn)。
（1）細(xì)胞因子&生物標(biāo)志檢測(cè)
Human IFNγ 為例
THUNDER細(xì)胞因子檢測(cè)是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的IFNγ抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細(xì)胞上清中IFNγ結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與IFNγ濃度成正比。全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測(cè)靈敏度高，上限寬。
Human IFNγ檢測(cè)范圍：32 – 30,000 pg/mL
圖：Human IFNγ檢測(cè)原理，流程及標(biāo)曲
（2）磷酸化蛋白檢測(cè)
THUNDER磷酸化蛋白和總蛋白檢測(cè)是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的蛋白抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細(xì)胞上清中目標(biāo)蛋白結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白濃度成正比。以磷酸化ERK為例，全程僅需4.5h，免洗，可高通量。檢測(cè)靈敏度高，上限寬。
圖3. THUNDER磷酸化蛋白檢測(cè)原理示意圖
該試劑盒已通過驗(yàn)證，適用于HEK293、H358、MCF7和B淋巴細(xì)胞裂解液中磷酸化- ERK1 /2（T202/Y204）的相對(duì)定量。用EGF處理HEK293細(xì)胞（50000個(gè)細(xì)胞/孔）與不同梯度濃度的EGF在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，EGF促進(jìn)ERK磷酸化。饑餓處理不同密度的H358細(xì)胞18個(gè)小時(shí)，用不同梯度濃度的RMC-4550在37℃下孵育60分鐘。數(shù)據(jù)顯示，RMC-4550可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點(diǎn)的磷酸化。用不同梯度濃度的L779,450處理不同密度的MCF7細(xì)胞，在37℃下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點(diǎn)的磷酸化。在不含血清的RPMI中重懸不同密度的B淋巴細(xì)胞，用不同梯度濃度的L779,450在室溫下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點(diǎn)的磷酸化。
圖. THUNDER Extreme Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)驗(yàn)證數(shù)據(jù)
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標(biāo)簽：
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