自體體外、通用體外和體內(nèi)CAR工程化免疫細(xì)胞療法的區(qū)別對(duì)比

文章來源公眾號(hào)：藥啟程            作者：phoebe

簡(jiǎn)介
嵌合抗原受體（CAR）工程化免疫細(xì)胞療法代表了癌癥治療領(lǐng)域的一項(xiàng)重大進(jìn)展。然而，復(fù)雜的體外細(xì)胞制備流程和嚴(yán)格的患者篩選標(biāo)準(zhǔn)限制了其廣泛應(yīng)用。

體內(nèi)CAR工程正成為一種前景廣闊的“即用型”治療策略，具備簡(jiǎn)化生產(chǎn)、免除患者個(gè)體化制備、降低成本并簡(jiǎn)化供應(yīng)鏈等多重優(yōu)勢(shì)。大量臨床前研究激發(fā)了針對(duì)實(shí)體瘤等難治疾病的深入探索，并推動(dòng)了旨在提升體內(nèi)CAR工程療效、細(xì)胞治療持久性及安全性的新一代產(chǎn)品開發(fā)。

一、3種方式對(duì)比（自體體外、通用體外和體內(nèi)）
（1）所有已上市的 CAR-T 產(chǎn)品均基于自體 T 細(xì)胞的體外工程：先從患者體內(nèi)分離 T 細(xì)胞，再用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒將 CAR 基因?qū)�入其中；隨后給予淋巴細(xì)胞清除預(yù)處理，使工程細(xì)胞獲得穩(wěn)態(tài)優(yōu)勢(shì)（減少與內(nèi)源免疫細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)，并清除可能抑制 CAR-T 功能的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞，從而增強(qiáng)其存活、擴(kuò)增及抗腫瘤效力）；最后將改造后的細(xì)胞回輸同一患者（圖 1a）。這種“一人一藥”的個(gè)性化制造模式復(fù)雜且昂貴，難以像常規(guī)藥品那樣批量生產(chǎn)，成為推廣應(yīng)用的主要障礙。

圖 1 | 體外自體和同種異體 CAR-T 細(xì)胞療法與體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞療法概覽

（2）為克服自體 CAR-T 的生產(chǎn)難題，多種策略已被提出。其中最具前景的是“即用型”同種異體 CAR 工程細(xì)胞產(chǎn)品：從健康供者獲取細(xì)胞，經(jīng)工程改造后制成可凍存的通用庫存（圖 1b）。其優(yōu)點(diǎn)包括產(chǎn)品可立即使用、制造工藝標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)胞改造時(shí)間充裕，并通過工業(yè)化流程降低成本。然而，同種異體CAR-T存在致命的移植物抗宿主�。℅vHD）風(fēng)險(xiǎn)。雖然已有緩解策略在開發(fā)，但仍需淋巴細(xì)胞清除以防止宿主排斥，而清淋常伴隨長(zhǎng)期血細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞缺乏及反復(fù)感染。因此，亟需全新策略，在保持高效殺瘤活性的同時(shí)降低制造復(fù)雜度和成本。

（3）直接在患者體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞（即“體內(nèi)CAR工程”）被視為解決上述難題的潛在突破口（表 1，圖 1c）。這種即用型產(chǎn)品可在受者體內(nèi)即時(shí)產(chǎn)生CAR免疫細(xì)胞，省去個(gè)體化制造，簡(jiǎn)化物流，顯著降低成本并縮短治療等待時(shí)間。此外，采用非整合載體的體內(nèi)方法或可避免體外永久基因修飾所帶來的T細(xì)胞耗竭與安全隱患。

二、體內(nèi)CAR不同方式對(duì)比
（1）LNP包裹的核酸
裝載mRNA的LNP（LNP–mRNA）技術(shù)依托一套成熟的大規(guī)模臨床生產(chǎn)體系，這一點(diǎn)已由冠狀病毒病（COVID-19）疫苗的成功量產(chǎn)所證明。FDA的批準(zhǔn)也進(jìn)一步確認(rèn)了其安全性，并凸顯了其在更廣泛治療場(chǎng)景中的潛力，例如體內(nèi)CAR工程。

給藥后，LNP–mRNA 會(huì)被多種細(xì)胞攝取，特別是靜脈注射時(shí)主要由肝細(xì)胞內(nèi)吞。進(jìn)入細(xì)胞后，mRNA從晚期內(nèi)體逃逸至胞質(zhì)，短暫翻譯后隨即降解。在LNP表面偶聯(lián)抗體可使其被特定細(xì)胞類型選擇性攝取。

由于mRNA僅停留在胞質(zhì)，本身不穩(wěn)定，不能整合進(jìn)基因組，且在細(xì)胞分裂過程中會(huì)被稀釋，因此基于LNP–mRNA 的工程化方案天然是“一過性”的。這意味著，若想在體內(nèi)持續(xù)維持CAR表達(dá)的治療效果，就必須頻繁、重復(fù)給藥。

臨床前研究表明，利用 LNP–mRNA 技術(shù)在體生成 CAR-T細(xì)胞在癌癥免疫治療中具有巨大前景（圖 2a）。如此生成的 CAR-T 細(xì)胞因其“短暫存在”而有望降低潛在毒性，并允許精準(zhǔn)劑量控制；同時(shí)無需在注射前進(jìn)行淋巴細(xì)胞清除。

圖 2 | T 細(xì)胞體內(nèi) CAR 工程的現(xiàn)有策略及作用機(jī)制

目前多數(shù)借助 LNP 在體內(nèi)制備 CAR-T 細(xì)胞的研究，均在納米顆粒中摻入可識(shí)別 CD3、CD4、CD5、CD7 或 CD8 的抗體或單鏈可變片段（scFv）。

抗體標(biāo)記的 LNP（以及后文將討論的聚合物納米顆粒）具有獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）特征。靜脈注射 4 小時(shí)后，非靶向納米顆粒主要被肝臟攝取，而經(jīng)CD3或CD8抗體修飾的淋巴細(xì)胞靶向納米載體則優(yōu)先富集于富含 T 細(xì)胞的組織，如脾臟、淋巴結(jié)和骨髓。然而，在LNP表面偶聯(lián)靶向配體會(huì)使制造工藝復(fù)雜化，降低產(chǎn)率和穩(wěn)定性，且產(chǎn)品無法長(zhǎng)期冷凍保存。

（2）LNP 或聚合物封裝核酸
陽離子可降解聚(β-氨基酯)（PBAE）聚合物制劑可通過靜電作用與帶負(fù)電的核酸（DNA 或 mRNA）自組裝，并在內(nèi)吞后依賴pH變化實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸。研究人員進(jìn)一步將這些聚合物與含有微管相關(guān)序列和核定位信號(hào)的肽段偶聯(lián)，借助微管運(yùn)輸機(jī)制加速遺傳貨物入核。

PBAE聚合物納米顆�？缮�物降解，在人源化小鼠體內(nèi)循環(huán)半衰期僅1–7小時(shí)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，即使高劑量顱內(nèi)給藥也未見毒性。其制備可采用納米沉淀、乳液聚合或溶劑揮發(fā)等成熟工藝，且可通過凍干制成干粉，便于儲(chǔ)存、提高穩(wěn)定性并降低成本。臨床前模型已證實(shí)，PBAE納米顆�？捎糜隗w內(nèi)T細(xì)胞基因工程（圖 2b）及體外巨噬細(xì)胞基因工程。

為實(shí)現(xiàn)對(duì) T 細(xì)胞的特異性遞送，研究者將聚谷氨酸與抗 CD8 或抗 CD3 抗體偶聯(lián)，該復(fù)合物再通過靜電作用吸附于 PBAE 顆粒表面。隨后，這些靶向納米顆粒可裝載： 
• 質(zhì)粒 DNA（可設(shè)計(jì)為整合或非整合型）； 
• 轉(zhuǎn)座子DNA（可將構(gòu)建體整合到安全港位點(diǎn)26,27）； 
• 編碼CAR的mRNA。

綜上，PBAE聚合物納米顆粒制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高，便于儲(chǔ)存且成本較低，為體內(nèi)誘導(dǎo) CAR-T 細(xì)胞免疫提供了可行、靈活且適用范圍廣的解決方案。然而，與LNP相比，后者在包封效率、抗降解保護(hù)及臨床 mRNA疫苗應(yīng)用中已建立的安全性方面更具優(yōu)勢(shì)，但PBAE納米顆粒仍需就規(guī)模化生產(chǎn)、長(zhǎng)期生物相容性及潛在毒性進(jìn)行深入研究。

（3）慢病毒遞送系統(tǒng)
慢病毒是一類具有球形包膜、單股RNA基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒亞型，因其能將外源基因整合到宿主基因組中，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)。慢病毒載體已被廣泛用于向T細(xì)胞遞送外源基因。然而，其在體內(nèi)的感染效率常受限于病毒本身對(duì)靶細(xì)胞的低親和力以及T細(xì)胞通常處于靜息狀態(tài)。為提高其體內(nèi)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，研究者采用了多種病毒包膜進(jìn)行假型化，包括尼帕病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒以及 cocal 融合糖蛋白等。此外，慢病毒還可通過將單鏈抗體（scFv）或設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPins）與病毒表面的糖蛋白復(fù)合體基因融合，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定 T 細(xì)胞亞群的靶向感染（圖 2c）。

慢病毒已被廣泛用于體外治療應(yīng)用，其臨床級(jí)生產(chǎn)工藝及試劑已成熟，可實(shí)現(xiàn) CAR 轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合與表達(dá)。然而，當(dāng)用于體內(nèi)時(shí)，病毒永久整合帶來的安全性顧慮顯著升高，包括可控整合、潛在非預(yù)期突變及長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)等問題。因此，體內(nèi)應(yīng)用慢病毒載體需對(duì)靶細(xì)胞類型實(shí)施嚴(yán)格控制，且僅在經(jīng)過嚴(yán)格安全性評(píng)估后才可能進(jìn)入臨床試驗(yàn)并最終獲批。

（4）基于 AAV 的遞送系統(tǒng)
腺相關(guān)病毒（AAV）是一種無包膜的小病毒，具有二十面體衣殼結(jié)構(gòu)和單鏈DNA基因組，不會(huì)整合到宿主基因組中。其衣殼可被工程化改造，以展示scFv、DARPins等多種蛋白；這些衣殼修飾對(duì)于實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞靶向、減少非特異性攝取至關(guān)重要。

憑借長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)、表型糾正能力強(qiáng)且毒性低等優(yōu)勢(shì)，AAV已成為治療性基因遞送的關(guān)鍵載體。與慢病毒相比，AAV DNA以穩(wěn)定的附加體形式存在，可抵抗外切酶降解，并利用宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成脫殼。這種穩(wěn)定性及附加體持久存在特性，使AAV成為體內(nèi)基因操作的理想載體，且不帶來插入突變風(fēng)險(xiǎn)。然而，AAV編碼的CD4靶向CAR在記憶T細(xì)胞中長(zhǎng)期存在，可能加劇CD4⁺ T細(xì)胞缺乏，因此在臨床應(yīng)用中必須配備有效的安全開關(guān)。

（5）生物指令可植入支架
將病毒載體預(yù)載入可植入多功能海藻酸支架，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的工程化與釋放，是“體內(nèi)”與“體外”策略的混合方案。其仍需先自患者分離T細(xì)胞，但處理時(shí)間縮短至一天。不同于其他體內(nèi)工程方法，海藻酸支架提供了一個(gè)局部、可控的微環(huán)境，增強(qiáng) T 細(xì)胞與病毒載體、細(xì)胞因子、趨化因子之間的相互作用。通過空間局限化，可提升CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并減少全身工程化帶來的潛在副作用（圖 2d）。

（6）Cas9 包膜遞送載體（Cas9-EDVs）
病毒或病毒衍生顆粒在體內(nèi)基因工程中可能因非靶細(xì)胞的意外轉(zhuǎn)導(dǎo)而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，這是重大局限。

為此，研究者開發(fā)了一種技術(shù)：利用可預(yù)測(cè)的抗體–抗原相互作用，將基因組編輯機(jī)器瞬時(shí)、精準(zhǔn)地遞送至目標(biāo)細(xì)胞，從而在預(yù)設(shè)基因組位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)精確且永久的基因編輯，同時(shí)最大限度減少對(duì)旁觀細(xì)胞的脫靶影響。

（7）病毒擬態(tài)融合納米囊泡（FuNVs）
預(yù)制的CAR蛋白亦可直接插入T細(xì)胞膜內(nèi)。該方法使CAR蛋白僅存在有限時(shí)間，從而降低持續(xù)CAR 介導(dǎo) T細(xì)胞活化引發(fā)的細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）風(fēng)險(xiǎn)，且不存在插入突變可能。

研究者借助病毒擬態(tài)FuNVs實(shí)現(xiàn)工程蛋白的直接插入。FuNVs整合了T細(xì)胞融合原—抗人CD3 scFv，以及如CD19 CAR的CAR蛋白（圖 2f）。

三、體內(nèi)和體外工程對(duì)比
體內(nèi)或體外每種途徑各有優(yōu)勢(shì)，也面臨獨(dú)特挑戰(zhàn)，涉及生產(chǎn)物流、療效及安全/毒性考量（表 3）。以下從三方面系統(tǒng)比較。

一、物流與制造
體外自體 CAR-T：生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)、規(guī)模化難、成本高
體外異體 CAR-T：現(xiàn)貨供應(yīng)、可規(guī)模放大，成本低于自體產(chǎn)品。
體內(nèi) CAR-T：“現(xiàn)貨”+“自體”雙重屬性：簡(jiǎn)化放行檢測(cè)、縮短供應(yīng)鏈，降低成本與周期。
     
二、療效
體外自體 CAR-T:對(duì)血液瘤成功，對(duì)實(shí)體瘤療效有限;回輸前需淋巴清除，導(dǎo)致免疫抑制；單靶點(diǎn)易逃逸；回輸前體外長(zhǎng)期激活可致耗竭。

體內(nèi) CAR-T
 • 在 TME 內(nèi)持續(xù)編輯與擴(kuò)增，克服遷移與持久性不足。
 • 可多靶點(diǎn)（多 mRNA 或病毒）或序貫給藥，降低逃逸風(fēng)險(xiǎn)。
 • 無淋巴清除，保留免疫系統(tǒng)完整性，促進(jìn)表位擴(kuò)散。
 • 可與 siRNA、細(xì)胞因子 mRNA 聯(lián)合，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié) TME。
 • 初期 CAR⁺ 細(xì)胞數(shù)量少，需體內(nèi)擴(kuò)增，或延遲起效；腫瘤患者 T 細(xì)胞數(shù)量/功能受損時(shí)療效受限。
 • 體內(nèi)分布、遷移、PK/PD 復(fù)雜；非整合載體表達(dá)短暫；整合載體需權(quán)衡插入突變風(fēng)險(xiǎn)。

三、安全與毒性
體外 CAR-T:需淋巴清除化療，帶來相應(yīng)毒性;CRS/ICAN;慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒整合存在插入突變風(fēng)險(xiǎn)。

體內(nèi) CAR-T:無需淋巴清除，避免相關(guān)毒性;非整合載體（mRNA等）無插入突變，可隨時(shí)調(diào)整劑量，降低 CRS/ICAN;脫靶遞送可能導(dǎo)致非目標(biāo)細(xì)胞異常 CAR 表達(dá)，需精準(zhǔn)靶向以避免生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前更傾向使用非整合或位點(diǎn)特異性整合載體。

四、展望
與現(xiàn)有的體外制備自體 CAR-T 細(xì)胞相比，體內(nèi) CAR 工程技術(shù)在治療癌癥等疾病時(shí)兼具經(jīng)濟(jì)與物流優(yōu)勢(shì)：可作為“即用型”產(chǎn)品，卻仍能在患者體內(nèi)生成個(gè)體化工程細(xì)胞，并省去淋巴細(xì)胞清除等預(yù)處理步驟。簡(jiǎn)化的生產(chǎn)流程有望為罹患多種疾病的數(shù)百萬患者提供切實(shí)可行、可規(guī)�；�的治療手段。

然而，這些研究?jī)H限于同系或人源化小鼠模型。要在人類中確立體內(nèi) CAR 工程的可行性、療效與安全性，有待開展臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。體內(nèi) CAR 療法的臨床試驗(yàn)必須慎思倫理問題，尤其當(dāng) FDA 已批準(zhǔn)的自體 CAR-T 成為標(biāo)準(zhǔn)治療時(shí)。確保信息透明與知情同意，充分告知潛在風(fēng)險(xiǎn)、獲益及不確定性，是倫理實(shí)踐的核心�？赡艿呐R床應(yīng)用場(chǎng)景包括：難治性癌癥、復(fù)發(fā)/難治且選擇有限的患者，以及在高度監(jiān)管的專業(yè)中心開展的先導(dǎo)研究。適應(yīng)性試驗(yàn)設(shè)計(jì)可在這些情境下迭代優(yōu)化安全性、療效與可行性評(píng)估，為更廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

在各類體內(nèi) CAR 工程平臺(tái)中，基于 LNP-mRNA 的 CAR 最具率先進(jìn)入臨床的潛力，其瞬時(shí)表達(dá)特性雖可能限制長(zhǎng)期 CAR 存在，卻有利于降低毒性并允許無基因組整合風(fēng)險(xiǎn)的再次給藥。相比之下，慢病毒載體因插入突變和脫靶整合顧慮而障礙較大，除非開發(fā)出更安全的定點(diǎn)整合策略。

總體而言，體內(nèi) CAR 工程領(lǐng)域方興未艾，有望帶來醫(yī)學(xué)治療的重大飛躍。要將其確立為新治療范式，需要科學(xué)家、臨床醫(yī)師與生物技術(shù)公司緊密合作，共同解決懸而未決的問題，并在療效與安全性之間持續(xù)優(yōu)化載體設(shè)計(jì)。