PD-L1的發(fā)現(xiàn)、信號傳導(dǎo)機制及做出漂亮WB條帶的方法
PD-L1
全名叫程序性細胞死亡蛋白 1 配體 1(Programmed cell death 1 ligand 1)，也稱為表面抗原分化簇274(Cluster of differentiation 274，CD274)或 B7同源體1(B7 homolog 1，B7-H1)，由CD274基因編碼，是細胞表面配體 B7 家族的一員。那么它是怎么被發(fā)現(xiàn)的呢？
其實首先發(fā)現(xiàn)的是PD-1。1992 年 Y·Ishida 及其團隊在研究細胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫環(huán)境內(nèi)還存在一種特殊受體，并將這種抑制T細胞免疫活性的分子命名為細胞程序性死亡受體（programmed cell death protein 1，PD-1，CD279）。2000年 Y·Ishida 聯(lián)合哈佛大學醫(yī)學院丹娜法伯癌癥研究院共同發(fā)表了以 PD-1 腫瘤免疫理論為基礎(chǔ)的重要論文，繼抑制T細胞免疫活性的受體分子后又發(fā)現(xiàn)B7蛋白家族配體細胞程序性死亡配體1，闡述了 PD-1 /PD-L1 參與調(diào)控 T 細胞分泌細胞因子的作用過程。
從此，PD-1/PD-L1信號通路便一發(fā)“不可收拾”，成為研究腫瘤免疫逃逸和治療的熱點。
如上圖所示，在腫瘤細胞上表達的PD-L1可與免疫細胞的PD-1受體結(jié)合，促進免疫細胞的失活或凋亡，使腫瘤細胞免疫逃逸和增殖。PD-1/PD-L1的相互作用還會抑制免疫細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)免疫刺激性細胞因子的分泌，增加免疫抑制性細胞因子的產(chǎn)生。
在許多癌癥中，腫瘤固有的PD⁃L1 信號通路通常處于異常激活狀態(tài)。PD⁃L1 異常激活的機制有很多，例如基因組改變（擴增和調(diào)節(jié)）、組成性癌基因信號激活（MYC、RAS、EGFR）、外源性因素（IFN-γ、TNF-α、EGF、IL-17、IL-27）、表觀遺傳機制（miRNA、異常的DNA甲基化和組蛋白修飾）。另外，腫瘤微環(huán)境中存在的某些炎癥因子也會誘導(dǎo) PD-L1 異常表達，加速 PD-L1 與 PD-1 相互作用，最終使免疫細胞耗竭無法完成免疫調(diào)節(jié)。可見PD-L1的調(diào)控不僅僅某一單一因素，正是這種表達的多樣性，使得 PD-L1 成為了人們關(guān)注的焦點。
圖2 PD-L1 的表達調(diào)控
那么我們介紹了PD-L1，怎么樣才能做出漂亮的WB條帶呢？
01 確定好的研究對象
有一個合適的研究對象，實驗就成功了一半。研究表明， PD-L1 在黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌和腎細胞癌等許多腫瘤類型的細胞中表達。PD-L1 在癌細胞中的表達與腫瘤浸潤性淋巴細胞有關(guān)，可通過釋放IFNγ介導(dǎo) PD-L1 表達。也有研究表明 PD-L1 表達與病毒感染相關(guān)癌癥有關(guān)。
雖然PD-L1在許多癌細胞中表達，但不代表每種腫瘤細胞都能檢測到PD-L1的表達。因此，在選擇某種特定細胞進行探究實驗時，最好先查閱文獻和數(shù)據(jù)庫看看是否有足夠的表達量。也可以同時使用表達量高的細胞樣本（如HDLM-2、MDA-MB-231）或者肺癌組織作為陽性對照來進行實驗。如果HDLM-2、MDA-MB-231這些細胞難以獲得，可以采用IFN-γ誘導(dǎo)的方法，劑量和時間可以依據(jù)參考文獻。
圖3 THE HUMAN PROTEIN ATLAS中PD-L1在各種細胞系的表達量
02 制樣時要超聲
如果樣本中PD-L1的表達量不高，裂解細胞的時候加以超聲，有助于斷裂染色質(zhì)，同時增加蛋白的可溶性。對于主要表達在膜上的PD-L1，更容易使抗原表位充分暴露出來，與抗體結(jié)合更容易。
超聲的方法也比較簡單，細胞或組織裂解后，置于冰上，超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒有超聲儀，可以采用1ml 帶針頭的注射器冰上反復(fù)抽吸10-15 次替代，直到裂解液澄清好吸為止。
03 裁膜范圍要寬
取什么樣的裁膜范圍合適呢？這要根據(jù)PD-L1的分子量和修飾情況來定。
PD-L1全長290個氨基酸，分子量約33kDa，由于剪切可產(chǎn)生2個異構(gòu)體，所以有時做Western出兩個條帶也不要詫異。
PD-L1的活性和穩(wěn)定性受到各種PTM的調(diào)控。糖基化和棕櫚酰化對于維持 PD-L1 的穩(wěn)定性至關(guān)重要。此外，糖基化還會影響 PD-L1 和 PD-1的結(jié)合。由于PD-L1含有多個糖基化修飾位點，在不同樣本中，糖基化修飾的水平不一致，我們實際觀察到的條帶位置也不在33KDa，通常在40-50kDa，所以各位同學裁膜時要包含30-70kDa的區(qū)域，足夠涵蓋絕大部分情況了。
圖4 PD-L1的翻譯后修飾現(xiàn)象
04 mRNA表達水平僅能作為參考項
PD-L1的mRNA水平與蛋白質(zhì)表達水平可能不一致。
下圖文獻中雖然正常細胞檢測到了mRNA的表達，可以確定該劑量藥物的誘導(dǎo)下，mRNA水平顯著上升，但是由于WB的靈敏度問題或者蛋白表達水平低，WB實驗中還是沒有檢測到正常細胞的PD-L1，最后是通過過表達才能檢測到條帶。
圖5 PD-L1在AGS、SNU-719的表達水平
部分相關(guān)產(chǎn)品：
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
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PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb |
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PD-L1 (Extracellular Domain Specific) (D8T4X) Rabbit mAb |
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PD-L1 (405.9A11) Mouse mAb |
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PD-L1 (D4H1Z) Rabbit mAb |
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Rabbit anti-PD-L1 Monoclonal Antibody |
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Rabbit anti-PD-L1 Monoclonal Antibody |
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InVivoSIM anti-human PD-L1 (Atezolizumab Biosimilar) |
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InVivoMAb anti-human PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoMAb anti-mouse PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoPlus anti-mouse PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoMAb anti-mouse PD-L1 (B7-H1) |
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InVivoMAb anti-mouse PD-1 (CD279) |
參考文獻：
1.Xianjie Jiang, Jie Wang, Xiangying Deng et al. Role of the tumor microenvironment in PDL1/PD-1-mediated tumor immune escape. Molecular Cancer (2019) 18:10.
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3.Jong-Ho Cha1, Li-Chuan Chan, Chia-Wei Li et al. Mechanisms controlling PD-L1 expression in cancer. Mol Cell. 2019 November 07; 76(3): 359–370.
4.宋若飄，臧愛民，賈友超. PD⁃L1在腫瘤細胞中表達調(diào)控機制研究進展. The Journal of Practical Medicine 2020 Vol.36 No.10.
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