Caspase蛋白的種類、活化機制和檢測技巧
上期小優細節君聊了下如何做好NRF2，沒想到反響還不錯，很多老師說對他們的實驗很有幫助。最近又碰到一個老師對Caspase很有興趣，Caspase相信大家都不陌生，凋亡劊子手、炎癥之友，但熟悉不一定好做，尤其是剪切體的Western。下面就讓我們一起看看細節君是如何見招拆招的。
細節君,老板讓我最近看看Caspase,你給我講講唄。
小優細節君：Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，能夠特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵。現已發現的哺乳動物細胞Caspase家族成員共15種，他們有相似的氨基酸序列、結構和底物特異性。
那這15種Caspase蛋白有什么區別？
小優細節君：由于Caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦觸發，即呈級聯放大效應。根據Caspase在級聯反應上、下游的位置及功能的不同，可分為三大類:
第1類為凋亡始動子,位于級聯反應上游,包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,該類蛋白酶的氨基端有一段特殊結構域,如Caspase-2,-9上的CARD結構和Caspase-8,-10上的DED結構,使其可與具備同源結構的銜接蛋白結合并發生聚集, 進而引發自身激活并激活下游的Caspase。
第2類為凋亡效應子,位于級聯反應下游,包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7,該類蛋白酶在受到起始凋亡蛋白酶的切割后被激活，活化后的效應凋亡蛋白酶通過對維持細胞結構及生命活動所必須的蛋白進行一一裂解,導致細胞結構的破壞及DNA損傷斷裂，最終引起細胞死亡。
第3類包括Caspase-1、Caspase-4、Cas-pase-5、Caspase-11、Caspase-12,主要參與細胞因子介導炎癥反應并在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中起輔助作用。
你剛說的活化是什么意思呢？
小優細節君：Caspase家族通常以無活性的蛋白酶原形式,酶原分子量在30-50 KD之間,由NH末端區、大亞基(P17-20)、小亞基(P10-12)及連接大小亞基的連接區組成。Caspase酶原分子激活后，大小亞基解離并重新組裝異源二聚體，再由兩個二聚體組成有活性的四聚體。
Caspase家族有這么多，我該如何開始做呢？
小優細節君：建議可以先觀察Caspase-3的變化,Caspase-3在細胞凋亡中是關鍵的執行者。Caspase-3一旦被激活，即發生下游的級聯反應，使凋亡不可避免，對許多關鍵的蛋白起著部分或全部的裂解作用，如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)及眾多細胞骨架相關的蛋白，因而Caspase-3也被稱為“YAMA”（閻羅王）。
那Caspase-3是如何活化的？
小優細節君：正常情況下，細胞中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，細胞凋亡信號的出現可導致Caspase-3(32kDa)前體轉變為成熟體，成熟的Caspase-3由亞基p17(17kDa)和亞基p12(12kDa)組成。
Caspase-3前體的裂解位點為ESMD2S(氨基酸25-29)和IETD2S(氨基酸172-176)。Caspase-3從前體Caspase-3轉變成成熟Caspase-3分兩個步驟形成,首先在IETD2S位點被切割,產生p12亞基和20kDa(p20)肽,接著p20在ESMD2S位點被切割,產生成熟的p17亞基。
為什么有的組織檢測不到Caspase-3？
小優細節君：Caspase-3 在一些組織中的蛋白表達較低，很難檢測到，例如大腦皮層，平滑肌，骨骼肌等。其實這個也可以理解，這個和每個組織本身的凋亡水平是密切相關的。
為什么western只能檢測到Caspase-3的前體，檢測不到剪切體呢？
小優細節君：最關鍵的原因是凋亡誘導的成功與否。
如果是做經典模型，要多參考文獻中的條件設置；
如果是探索性的實驗，務必要設置藥物誘導時間和濃度梯度的預實驗，來確定特定細胞系中誘導Caspase-3 活化的最佳條件。
如果不確定藥物是否可以誘導，強烈建議加入陽性對照，可以參考CST使用依托泊苷(25 uM for 5 hours)或十字孢堿(1uM for 3hours)處理的Jurkat、NIH/3T3細胞。
↓下圖是某位老師自己的樣本和處理方式與CST陽性對照的對比結果圖，也驗證了細胞系和誘導處理方式是做出Caspase-3剪切條帶的關鍵因素。
我做的是貼壁細胞，要不要收集上清中的細胞？
小優細節君：細胞發生凋亡后會變得難貼壁，需離心收集所有的懸浮細胞。
其他western步驟還有沒有什么需要注意的呢？
小優細節君：1. 裂解樣本的時候要超聲,使目的蛋白溶出更加充分,這點在做其他靶標也是一樣的。
2. 保證足夠的蛋白上樣量,組織樣本推薦50~100μg,細胞樣本推薦20~50μg。
3. Caspase-3 剪切體分子量較少,注意轉膜時間不能太久,避免過度轉膜,同時膜要使用0.22μm。
我好不容易做出剪切體條帶了，但是趨勢不對，是什么原因呢？
小優細節君：做的趨勢不對的時候，也別急著懷疑自己或者懷疑試劑的問題，可以順著現象去探索問題的本質，很多出色的研究就是在“違背”我們所認為的常理中發現的。
例如在癌癥治療中，細胞凋亡是一種公認的細胞死亡機制，細胞毒性藥物通過它來殺死腫瘤細胞。但是在這篇研究中《Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy》，作者發現快要死亡的腫瘤細胞利用凋亡過程中產生的強有力的生長刺激信號來重新生長，進一步深入發現Caspase-3作為凋亡的執行者，竟然還在生長刺激中起著關鍵作用。所以說，任何不尋常的可重復的可靠實驗結果都值得我們認真對待。
怎么樣才能和小優細節君保持聯系呢？
小優細節君：電話：4008-168-068轉5，郵箱：techservice@univ-bio.com。
Caspase3相關產品
細節君,老板讓我最近看看Caspase,你給我講講唄。
小優細節君：Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，能夠特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵。現已發現的哺乳動物細胞Caspase家族成員共15種，他們有相似的氨基酸序列、結構和底物特異性。
那這15種Caspase蛋白有什么區別？
小優細節君：由于Caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦觸發，即呈級聯放大效應。根據Caspase在級聯反應上、下游的位置及功能的不同，可分為三大類:
第1類為凋亡始動子,位于級聯反應上游,包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,該類蛋白酶的氨基端有一段特殊結構域,如Caspase-2,-9上的CARD結構和Caspase-8,-10上的DED結構,使其可與具備同源結構的銜接蛋白結合并發生聚集, 進而引發自身激活并激活下游的Caspase。
第2類為凋亡效應子,位于級聯反應下游,包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7,該類蛋白酶在受到起始凋亡蛋白酶的切割后被激活，活化后的效應凋亡蛋白酶通過對維持細胞結構及生命活動所必須的蛋白進行一一裂解,導致細胞結構的破壞及DNA損傷斷裂，最終引起細胞死亡。
第3類包括Caspase-1、Caspase-4、Cas-pase-5、Caspase-11、Caspase-12,主要參與細胞因子介導炎癥反應并在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中起輔助作用。
你剛說的活化是什么意思呢？
小優細節君：Caspase家族通常以無活性的蛋白酶原形式,酶原分子量在30-50 KD之間,由NH末端區、大亞基(P17-20)、小亞基(P10-12)及連接大小亞基的連接區組成。Caspase酶原分子激活后，大小亞基解離并重新組裝異源二聚體，再由兩個二聚體組成有活性的四聚體。
Caspase家族有這么多，我該如何開始做呢？
小優細節君：建議可以先觀察Caspase-3的變化,Caspase-3在細胞凋亡中是關鍵的執行者。Caspase-3一旦被激活，即發生下游的級聯反應，使凋亡不可避免，對許多關鍵的蛋白起著部分或全部的裂解作用，如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)及眾多細胞骨架相關的蛋白，因而Caspase-3也被稱為“YAMA”（閻羅王）。
那Caspase-3是如何活化的？
小優細節君：正常情況下，細胞中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，細胞凋亡信號的出現可導致Caspase-3(32kDa)前體轉變為成熟體，成熟的Caspase-3由亞基p17(17kDa)和亞基p12(12kDa)組成。
Caspase-3前體的裂解位點為ESMD2S(氨基酸25-29)和IETD2S(氨基酸172-176)。Caspase-3從前體Caspase-3轉變成成熟Caspase-3分兩個步驟形成,首先在IETD2S位點被切割,產生p12亞基和20kDa(p20)肽,接著p20在ESMD2S位點被切割,產生成熟的p17亞基。
為什么有的組織檢測不到Caspase-3？
小優細節君：Caspase-3 在一些組織中的蛋白表達較低，很難檢測到，例如大腦皮層，平滑肌，骨骼肌等。其實這個也可以理解，這個和每個組織本身的凋亡水平是密切相關的。
為什么western只能檢測到Caspase-3的前體，檢測不到剪切體呢？
小優細節君：最關鍵的原因是凋亡誘導的成功與否。
如果是做經典模型，要多參考文獻中的條件設置；
如果是探索性的實驗，務必要設置藥物誘導時間和濃度梯度的預實驗，來確定特定細胞系中誘導Caspase-3 活化的最佳條件。
如果不確定藥物是否可以誘導，強烈建議加入陽性對照，可以參考CST使用依托泊苷(25 uM for 5 hours)或十字孢堿(1uM for 3hours)處理的Jurkat、NIH/3T3細胞。
↓下圖是某位老師自己的樣本和處理方式與CST陽性對照的對比結果圖，也驗證了細胞系和誘導處理方式是做出Caspase-3剪切條帶的關鍵因素。
我做的是貼壁細胞，要不要收集上清中的細胞？
小優細節君：細胞發生凋亡后會變得難貼壁，需離心收集所有的懸浮細胞。
其他western步驟還有沒有什么需要注意的呢？
小優細節君：1. 裂解樣本的時候要超聲,使目的蛋白溶出更加充分,這點在做其他靶標也是一樣的。
2. 保證足夠的蛋白上樣量,組織樣本推薦50~100μg,細胞樣本推薦20~50μg。
3. Caspase-3 剪切體分子量較少,注意轉膜時間不能太久,避免過度轉膜,同時膜要使用0.22μm。
我好不容易做出剪切體條帶了，但是趨勢不對，是什么原因呢？
小優細節君：做的趨勢不對的時候，也別急著懷疑自己或者懷疑試劑的問題，可以順著現象去探索問題的本質，很多出色的研究就是在“違背”我們所認為的常理中發現的。
例如在癌癥治療中，細胞凋亡是一種公認的細胞死亡機制，細胞毒性藥物通過它來殺死腫瘤細胞。但是在這篇研究中《Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy》，作者發現快要死亡的腫瘤細胞利用凋亡過程中產生的強有力的生長刺激信號來重新生長，進一步深入發現Caspase-3作為凋亡的執行者，竟然還在生長刺激中起著關鍵作用。所以說，任何不尋常的可重復的可靠實驗結果都值得我們認真對待。
怎么樣才能和小優細節君保持聯系呢？
小優細節君：電話：4008-168-068轉5，郵箱：techservice@univ-bio.com。
Caspase3相關產品
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貨號 |
產品名稱 |
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Caspase-3 Antibody |
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Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb |
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PARP (46D11) Rabbit mAb |
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Cleaved PARP (Asp214) (D64E10) XP® Rabbit mAb |
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Caspase-9 (C9) Mouse mAb |
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Cleaved Caspase-9 (Asp315) Antibody (Human Specific) |
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Bax (D2E11) Rabbit mAb |
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Bcl-2 (124) Mouse mAb |
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