Nature分享：BindCraft開源工具破解蛋白質結合劑設計難題

文章來源公眾號：Drug AI        作者：Drug AI

未來，或許只需輸入靶標結構，就能在幾天內獲得具備臨床潛力的功能分子

在生物醫學與生物技術領域，蛋白質-蛋白質相互作用（PPIs）是調控生命活動的核心機制，而設計能特異性靶向并調控PPIs的蛋白質結合劑，一直是開發治療藥物、診斷工具與分子生物學試劑的關鍵方向。傳統方法如免疫接種、抗體庫篩選或定向進化，不僅耗時費力，還難以精準控制結合位點，且實驗成功率常低于0.1%。即便近年來興起的計算設計方法，如基于Rosetta的物理模擬或結合RFdiffusion與ProteinMPNN的深度學習策略，仍存在 backbone生成與功能界面設計脫節、依賴高通量篩選等局限。

近期，EPFL×MIT團隊在《Nature》發表的題為“One-shot design of functional protein binders with BindCraft”的研究，提出了一款名為BindCraft的開源自動化設計流程，徹底改變了這一局面。該工具以AlphaFold2（AF2）為核心驅動，無需高通量篩選或實驗優化，就能從頭設計出納米摩爾級親和力的蛋白質結合劑，實驗成功率高達10%~100%，即便在未知結合位點的情況下仍能高效工作。

一、BindCraft：為何能突破傳統設計的“死穴”？

傳統計算設計方法的核心痛點，在于難以兼顧“結構準確性”與“功能有效性”——要么依賴固定靶標結構進行預定義支架對接，導致界面兼容性差；要么在backbone生成后難以精準優化功能界面。BindCraft的創新之處，在于直接將AF2的結構預測能力融入設計全過程，通過反向傳播（backpropagation）實現結合劑的結構、序列與界面協同優化，而非僅將AF2作為后續篩選工具。

其設計流程可概括為三大核心步驟：首先，基于AF2多聚體模型（AF2 multimer）初始化結合劑設計。由于AF2 multimer經蛋白質復合物數據訓練，能更精準模擬PPIs，相比單體模型可生成更大（平均大20%）、環結構占比更高且置信度更強的結合界面。設計初始階段，BindCraft會以隨機序列啟動結合劑“幻覺生成”（hallucination），通過AF2網絡計算設計損失（design loss），該損失函數整合了結合劑置信度（pLDDT）、界面置信度（i_pTM）、預測對齊誤差（pAE）、殘基接觸等9項關鍵指標，確保設計既符合結構合理性，又滿足功能需求。

其次，通過多階段序列優化提升結合劑的可溶性與穩定性。AF2幻覺生成的序列雖能保證界面結合活性，但常存在表達量低的問題。為此，BindCraft引入MPNNsol（一種消息傳遞神經網絡），在保持結合界面完整的前提下，對結合劑的核心與表面序列進行優化——這一步既能保留關鍵結合位點，又能改善蛋白質的可溶性與表達效率，解決了此前AF2幻覺蛋白“難表達”的共性問題。

最后，通過嚴格的多維度篩選確保設計質量。優化后的序列會經AF2單體模型重新預測（避免多聚體模型對PPIs的預測偏倚），再結合Rosetta的物理基于評分（如界面形狀互補性、氫鍵數量等），最終篩選出pLDDT>0.8、i_pTM>0.5、界面氫鍵>3等滿足嚴格標準的設計。整個流程完全自動化，用戶僅需提供靶標PDB結構與基本設計參數（如結合劑長度范圍），無需專業計算背景即可操作，真正實現了蛋白質結合劑設計的“民主化”。

值得注意的是，BindCraft還解決了傳統設計的另一大局限——靶標結構的“剛性依賴”。此前如RFdiffusion等方法需固定靶標backbone，而BindCraft在每輪設計迭代中都會重新預測結合劑-靶標復合物結構，允許靶標與結合劑的側鏈和backbone存在一定靈活性（靶標backbone的Cα RMSD可在0.5~5.5 Å范圍內調整），最終形成的結合界面能更精準地“貼合”靶標結合位點，這也是其能在未知結合位點場景下工作的關鍵。

圖1. 基于 BindCraft 的從頭結合劑設計流程與靶標概況。a 部分為 BindCraft 結合劑設計流程的示意圖，展示了從靶標蛋白質結構輸入到最終篩選獲得優化設計的完整步驟 —— 首先利用 AF2 多聚體模型生成結合劑的骨架與序列，接著在保持界面完整的前提下，通過 MPNN 對結合劑的表面和核心序列進行優化，最后基于 AF2 單體模型預測結果篩選出高質量設計；b 部分為結合劑設計的蛋白質靶標概覽，標注了各類靶標的結構特征（綠色為設計時使用的區域，灰色為排除區域）、實驗驗證的成功結合劑數量（藍色框內，分子結合通過 SPR 檢測）及最高親和力結合劑的解離常數（Kd，黃色框為實測值，橙色框為因擬合效果差的估算值），涵蓋細胞表面受體（如 PD-L1、PD-1）、常見過敏原（如 BetV1、DerF21）、多結構域核酸酶（如 SpCas9）等 12 類挑戰性靶標，其中 PD-1 結合劑以雙價 Fc 融合形式測試，部分靶標最低 Kd 可達 < 1 nM，直觀體現了 BindCraft 在不同類型靶標上的設計效率與親和力水平。

二、12類挑戰性靶標驗證：從細胞表面受體到核酸結合蛋白

一款蛋白質設計工具的價值，最終需通過實驗驗證其普適性與功能性。BindCraft團隊選擇了12類具有重要生物學與治療意義的靶標進行測試，涵蓋細胞表面受體、常見過敏原、從頭設計蛋白及多結構域核酸酶（如CRISPR-Cas9），每類靶標的設計結果都令人驚喜。

1. 細胞表面受體：精準靶向免疫檢查點與未知位點

細胞表面受體是免疫治療的核心靶標，但傳統抗體設計常受限于已知結合位點。BindCraft針對PD-1（免疫檢查點受體）設計的53個結合劑中，13個表現出結合活性，最優結合劑以雙價Fc融合形式存在時，表觀解離常數（Kd*）<1 nM，且與臨床藥物 pembrolizumab（帕博利珠單抗）競爭相同結合位點——這意味著其有望成為PD-1抑制劑的替代候選分子，且分子量更�。�60~240個氨基酸），可能具備更好的組織穿透性。

更值得關注的是，BindCraft對“無已知結合位點”靶標的設計能力。以CD45為例，其胞外域含4個免疫球蛋白樣結構域且高度糖基化，傳統方法難以定位結合位點。BindCraft設計的16個結合劑中，4個通過SPR驗證，最優結合劑（binder1）親和力達14.7 nM，且精準靶向d3與d4結構域的連接區域——這一結果證明，BindCraft無需依賴已知結合位點信息，僅通過靶標結構即可“自主”發現功能性結合區域，為難成藥受體的靶向提供了新策略。

圖2. 針對細胞表面受體的結合劑設計與功能驗證。a 為 binder2 與 PD-1 復合物的設計模型，b 為 BLI 傳感器圖顯示 binder2（雙價 Fc 融合形式）與 PD-1 的結合動力學，其 Kd*≤1 nM；c 為 binder4 與 PD-L1 的設計模型，d 為 SPR 測定的二者結合親和力（Kd*=615 nM）；e 為 binder5 與 IFNAR2 的設計模型，f 為 SPR 測定的二者結合親和力（Kd=260 nM）；g 為 binder1 與 CD45 的設計模型，h 為 SPR 測定的二者結合親和力（Kd=14.7 nM）；i 為基于 CpE 的細胞毒性及 CLDN1 結合劑抑制機制的示意圖；j 為 SPR 單循環動力學分析顯示 CLDN1 結合劑 12 與可溶性 CLDN1 類似物的結合；k 為細胞實驗表明 CLDN1 結合劑 9、12 能以濃度依賴方式抑制 CpE 誘導的細胞毒性，效果與已知 CpE 抑制劑相當；l 為 MST 測定顯示結合劑 12 可阻斷 CpE 與 CLDN1 WT 的結合，驗證了結合劑與 CpE 競爭相同結合位點的機制，全面證明了 BindCraft 設計的細胞表面受體結合劑在結構準確性、結合親和力及功能調控上的有效性。

2. 過敏原：從結構設計到臨床樣本驗證的“抗過敏”潛力

過敏原是一類極具挑戰性的設計靶標——其表面多帶高電荷，且傳統認為疏水性結合位點更易設計，而過敏原的親水性表面常導致設計失敗。BindCraft針對塵螨過敏原Der f7、Der f21及樺樹主要過敏原Bet v1（引發95%樺樹相關過敏）的設計，打破了這一認知。

針對Bet v1，BindCraft設計的7個結合劑中2個有效，最優結合劑（binder2）親和力達120 nM，且能與臨床候選抗體混合物（REGN5713/5714/5715）競爭相同表位。更關鍵的是，在患者血清樣本中，該結合劑能阻斷Bet v1與IgE的結合，最高阻斷率達50%——這一結果與單克隆抗體的阻斷效果相當，且結合劑穩定性更高，為過敏性疾病的“精準中和”提供了新方案。此外，針對Der f7的結合劑（binder2）還通過晶體結構驗證，其backbone與設計模型的RMSD僅1.7 Å，證明了BindCraft設計的結構準確性。

圖3. 阻斷常見過敏原表位的結合劑設計。a 左側為針對塵螨過敏原 Der f7 的 binder2 設計模型，右側為 SPR 測定的二者結合親和力（Kd=12.8 nM）；b 為 Der f7-binder2 復合物的晶體結構（彩色）與設計模型（灰色）疊加圖，驗證了設計的結構準確性；c 左側為針對塵螨過敏原 Der f21 的 binder10 設計模型，右側為 SPR 測定的二者結合親和力（Kd*=793 nM）；d 為 Der f21-binder10 復合物的晶體結構（彩色）與設計模型（灰色）疊加圖，因界面酪氨酸的旋轉異構體構象差異，backbone 的 RMSD 為 3.1 Å；e 左側為針對樺樹過敏原 Bet v1 的 binder2 設計模型，右側為 SPR 測定的二者結合親和力（Kd=120 nM）；f 為 SEC-MALS 分析顯示 Bet v1（藍色，預期分子量 18.5 kDa）與 binder2（橙色，預期分子量 29.3 kDa）形成 1:1 復合物（實測分子量 27.8 kDa）；g 為 Bet v1 與商業抗 Bet v1 REGN 抗體混合物結合的冷凍電鏡結構（PDB 7MXL）；h 為競爭實驗證實 binder2 與 REGN5713 抗體靶向 Bet v1 的重疊表位；i 為阻斷 ELISA 實驗顯示，binder2 能像 REGN 抗體混合物一樣，阻止 Bet v1 與樺樹過敏患者血清中 IgE 的結合，部分患者中阻斷率達 50%，體現了其抗過敏治療潛力。

3. 多結構域核酸酶：攻克“不可成藥”的核酸結合界面

核酸結合蛋白（如CRISPR-Cas9、Argonaute）的界面因大尺寸、高電荷、凸面結構，一直被認為是“不可成藥”靶點——小分子難以結合，傳統抗體又難以穿透核酸結合通道。BindCraft針對這類靶標的設計，首次證明了蛋白質結合劑可有效調控核酸酶活性。

在SpCas9（CRISPR基因編輯核心工具）的設計中，BindCraft靶向其REC1結構域（向導RNA結合口袋），6個測試結合劑全部能結合全長apo SpCas9，最優結合劑（binder3/10）親和力達300 nM級。功能實驗顯示，這些結合劑能顯著降低HEK293T細胞中的Cas9基因編輯效率，且抑制效果優于天然抗CRISPR蛋白AcrIIC2——這為基因編輯的“精準調控”提供了新工具，可有效降低脫靶效應。

更令人振奮的是對Argonaute核酸酶（CbAgo）的設計。CbAgo作為細菌免疫系統的關鍵分子，通過小核酸向導切割外源DNA，但目前尚無天然抑制劑報道。BindCraft針對其N-PIWI通道或PAZ結構域設計的12個結合劑中，2個能強效抑制CbAgo的DNA切割活性：加入2 μM binder2后，CbAgo的催化常數（kcat）從0.004 s⁻¹降至5×10⁻⁵ s⁻¹（降低80倍），且該結合劑能與CbAgo形成穩定復合物，通過競爭向導DNA（gDNA）結合位點發揮作用。這一結果不僅證明BindCraft可設計核酸結合界面的結合劑，更為開發新型核酸酶抑制劑提供了范式。

圖4. 針對核酸引導多結構域核酸酶的從頭結合劑設計。a 為 SpCas9 REC1 結構域與向導 RNA 結合的局部放大圖（PDB 4ZT0），標注了設計結合劑的結合口袋；b 為 binder3 與 apo 形式 SpCas9 結合的冷凍電鏡結構，REC1 結構域為綠色，其余部分為灰色，疊加了灰色的冷凍電鏡密度；c 為 binder10 與 apo 形式 SpCas9 結合的冷凍電鏡結構，標注方式同 b；d 為 HEK293T 細胞中 SpCas9 基因編輯效率實驗，顯示設計的結合劑（綠色柱）能顯著降低編輯效率，部分效果優于天然抗 CRISPR 蛋白（藍色柱）；e 為結合 gDNA 和 tDNA 的 Clostridium butyricum Argonaute（CbAgo）結構示意圖（PDB 6QZK），標注了設計靶向的 PAZ 結構域及 N+PIWI 結構域；f 為 CbAgo 介導的 tDNA 切割實驗，顯示設計的結合劑（綠色柱）能強效抑制切割活性；g 為時間依賴性的 CbAgo-gDNA 介導靶 DNA 切割曲線，顯示加入 binder2（粉色線）或 binder3（紫色線）后，切割效率顯著低于無結合劑組（灰色線），證實了結合劑對核酸酶活性的抑制作用。

三、從“設計”到“應用”：BindCraft的轉化潛力

優秀的技術不僅要解決科學問題，更要具備實際應用價值。BindCraft團隊在論文中展示了其在基因治療、毒素中和等領域的轉化潛力，其中最具代表性的是腺相關病毒（AAV）的靶向重定向。

AAV是基因治療的常用載體，但天然AAV靶向性差，常需高劑量給藥，導致脫靶效應與免疫原性風險。傳統AAV重定向方法依賴肽段插入或抗體片段融合，需大量篩選且難以控制結合位點。BindCraft的解決方案是：設計針對特定細胞表面受體（如HER2、PD-L1）的迷你蛋白結合劑，將其插入AAV衣殼的VR-V區域（經突變研究驗證的最優插入位點），同時通過突變敲除AAV對肝素與唾液酸的天然結合能力，實現“脫靶-重定向”雙重調控。

實驗結果顯示，針對HER2設計的結合劑（binder1）與PD-L1設計的結合劑（binder202），能使AAV特異性靶向表達HER2或PD-L1的HEK293細胞， transduction效率最高提升61倍，且當加入靶向PD-L1的抗體后，transduction被顯著阻斷——證明結合劑確實介導了AAV與靶標受體的特異性結合。這一成果為基因治療的“精準遞送”提供了新策略，可實現對疾病相關細胞的定向基因導入，降低系統毒性。

圖5. 通過 AAV 工程實現靶向基因遞送。該圖呈現了利用 BindCraft 設計的結合劑重定向 AAV 載體以實現靶向基因遞送的成果：a 為 AAV-cmv-GFP 重定向的示意圖，展示了通過插入細胞類型受體特異性迷你蛋白結合劑，替代 AAV 對細胞表面聚糖的天然結合，實現靶向遞送；b 為重定向 AAV 顆粒的嵌合組裝示意圖，包含天然亞基與插入結合劑的工程亞基，形成從頭設計的蛋白質 - 蛋白質相互作用；c 為流式細胞術檢測不同 AAV 變體對 HER2 或 PD-L1 過表達 HEK293 細胞的轉導效率，標注了信號噪聲比（× 倍），顯示靶向 HER2 和 PD-L1 的 AAV 變體轉導特異性顯著提升，而野生型（WT）和敲除型（KO）AAV 無特異性；d 為針對 HER2 的 binder1 設計模型；e 為針對 PD-L1 的 binder202 設計模型；f 為熱圖展示不同 AAV 變體在 HER2 或 PD-L1 過表達細胞上的轉導率，驗證了靶向變體的特異性；g 為 PD-L1 靶向 AAV 的轉導實驗，直方圖顯示加入抗 PD-L1 抗體后，轉導效率顯著降低，證實設計的結合劑介導了 AAV 與靶標受體的特異性結合，為精準基因治療提供了新策略。

BindCraft 設計的計算機模擬分析。該圖通過多維度數據對 BindCraft 的設計過程與結果進行計算機模擬驗證：a 為不同設計靶標在 AF2 結合劑幻覺生成后，靶標結構相對于輸入靶標結構的 Cα RMSD 值分布圖，體現了靶標結構的靈活性范圍；b 為螺旋度損失對 PD-L1 結合劑二級結構含量的影響，負權重值（抑制 α- 螺旋形成）可產生純 β- 折疊結合劑；c 為不同靶標和結合劑長度下，生成 100 個通過計算篩選的結合劑所需的 GPU 小時數，標注了需采樣的設計數量，對比了 BindCraft 與 RFdiffusion 的計算效率；d 為 BindCraft 與 RFdiffusion 在 PD-L1、IFNAR2、DerF7 和 BBF-14 四個靶標上，結合劑界面的氨基酸類型分布對比圖；e 為設計的結合劑折疊結構（綠色）及結合劑 - 靶標界面（粉色）與 PDB 中最相似結構的最大 TM 分數和序列同一性對比箱線圖，箱線圖中心線為中位數，箱體為 25%~75% 分位數，須為最小值和最大值，異常值為超出 1.5 倍四分位距的數據點，證實設計結合劑的結構與界面新穎性。

四、展望與局限：蛋白質設計邁入“按需定制”時代

BindCraft的出現，標志著計算蛋白質設計從“高通量篩選依賴”向“一次設計即獲功能分子”邁進。其平均46.3%的實驗成功率，遠超當前主流方法（如RFdiffusion約10%~20%），且無需依賴高通量篩選平臺，使普通實驗室也能開展高質量蛋白質結合劑設計。但作為研究者，我們也需客觀看待其局限：一是GPU計算成本較高，反向傳播過程對硬件要求較高；二是AF2單體模型篩選可能排除部分高親和力結合劑，且AF2對單點突變不敏感，需結合Rosetta等工具進一步驗證；三是結合劑的免疫原性與體內遞送問題仍需解決——盡管其分子量小于抗體，但合成蛋白的免疫原性仍需在動物模型中評估。

不過，這些局限并非不可克服。隨著AlphaFold3等新一代模型的出現，結合劑的設計精度有望進一步提升；而遞送技術（如納米顆粒、細胞穿透肽）的發展，也將助力結合劑的體內應用。更重要的是，BindCraft已開源，這意味著研究者可在此基礎上進行二次開發，推動技術快速迭代。

回顧蛋白質設計領域的發展，從早期Rosetta的“腳手架設計”到如今BindCraft的“協同優化”，我們見證了計算方法從“輔助篩選”到“主導設計”的轉變。BindCraft的成果不僅為治療（如抗過敏、基因編輯調控）、診斷（如特異性探針）與生物技術（如AAV靶向遞送）提供了新工具，更讓我們看到了“按需定制蛋白質結合劑”的可能性——未來，或許只需輸入靶標結構，就能在幾天內獲得具備臨床潛力的功能分子。

建議相關領域的研究者重點關注這一工具，無論是開發新型治療藥物，還是探索蛋白質相互作用的基本機制，BindCraft都將成為極具價值的研究助手。也期待未來能看到更多基于BindCraft的轉化研究，讓計算蛋白質設計真正從實驗室走向臨床。​