細胞培養中動物血清的常見問題及處理方法與預防措施！

動物血清（尤其是胎牛血清，FBS）是細胞培養中不可或缺的培養基添加劑，提供細胞生長所需的營養物質、激素、生長因子、結合蛋白等。然而，在使用過程中會遇到各種問題。了解這些問題及其處理方法對于保證實驗的穩定性和可重復性至關重要。
 
一、常見問題
1、沉淀/絮狀物： 
表現：血清解凍后出現白色、棕色或絮狀沉淀物，懸浮或沉于瓶底。 
原因： 
纖維蛋白/纖維蛋白原：這是最常見的原因，凝血過程中形成，尤其在反復凍融或溫度波動時析出。 
磷酸鈣：血清中鈣離子和磷酸根離子在特定條件下（如pH、溫度變化）結合形成。 
脂蛋白：血清中的脂類在低溫或長期保存時聚集。 
蛋白聚合物：血清蛋白變性或聚集。 
微粒：過濾不徹底或儲存過程中產生。 
影響：堵塞濾膜、影響細胞狀態（物理刺激、消耗養分）、影響實驗觀察（如顯微鏡下）。
 
2、顏色異常： 
表現： 
淡黃色/稻草黃：正常顏色。 
深黃色/琥珀色：通常由于保存時間過長或儲存溫度偏高導致血紅蛋白（血紅素）氧化。 
粉紅色/紅色：明顯的血紅蛋白污染（溶血），通常由于采血過程處理不當或凍融過程劇烈導致紅細胞破裂。 
渾濁/云霧狀：可能指示細菌污染或高脂血清。 
影響：深色可能不影響細胞生長，但影響光學觀察。粉紅色/紅色指示溶血，可能影響某些細胞類型（如神經元）。渾濁需警惕污染。
 
3、微生物污染： 
表現： 
細菌：培養基迅速渾濁、pH急劇下降（變黃）、鏡下可見大量活動小點。 
真菌/酵母：培養基中出現絮狀、絲狀或點狀懸浮物，pH變化，鏡下可見菌絲或孢子。 
支原體：培養基可能無明顯渾濁，但細胞狀態變差（生長緩慢、形態改變、易脫落、代謝異常），檢測需要特殊方法（PCR、DNA染色、培養法）。 
病毒：更難檢測，可能通過影響細胞表型或PCR等方法發現。 
原因：血清生產、分裝、運輸、儲存或使用過程中無菌操作不當引入。 
影響：導致細胞死亡、實驗結果無效、交叉污染整個實驗室。
 
4、細胞生長不良/毒性： 
表現：細胞貼壁差、增殖緩慢、形態異常、死亡率高、達不到預期密度。 
原因：
血清質量差：來源動物健康狀況差、生產工藝不佳、內毒素含量高、激素/生長因子水平不足或不穩定。 
批次差異：不同批次血清的成分（特別是生長因子、激素）存在自然差異。 
滅活處理不當：過度滅活（溫度過高、時間過長）破壞有益成分或產生毒性物質。 
污染：特別是支原體或病毒污染。 
沉淀物影響：物理刺激或消耗養分。 
儲存條件不當：反復凍融、長期置于4°C或更高溫度導致成分降解。 
內毒素含量高：內毒素（LPS）對某些細胞（如免疫細胞、原代細胞、干細胞）有很強毒性。 
影響：實驗失敗，結果不可靠，時間和資源浪費。
 
5、批次間差異： 
表現：同一細胞系使用不同批次的血清，生長速度、形態、代謝或特定功能表達不一致。 
原因：血清是天然產物，其成分受動物品種、年齡、地理位置、季節、飲食、采血和加工方法等多種因素影響，無法做到完全均一。 
影響：實驗可重復性差，更換批次時需要重新優化條件或驗證。
 
二、處理方法與預防措施
 
1、沉淀/絮狀物處理： 
輕微沉淀（常見纖維蛋白）：解凍后，溫和地將血清在2-8°C冰箱中靜置過夜，讓大部分沉淀沉底。然后小心吸取上清液使用（避免攪動沉淀）。通常不需要過濾去除，過度過濾會損失生長因子。 
大量沉淀或懷疑其他類型沉淀： 
離心：在2-8°C，以約2000-4000g離心5-10分鐘，小心吸取上清液。 
過濾：如果必須去除（例如做無血清實驗或特殊要求），使用孔徑≥0.45μm的低蛋白吸附濾膜過濾（0.22μm過濾會顯著損失有效成分）。僅在必要時進行！ 
預防： 
避免反復凍融：購買后立即分裝成小份（如50ml），儲存于-20°C（短期1-2年）或最佳為-70°C至-80°（長期保存）。 
規范解凍：從-20°C/-80°C取出后，先置于2-8°C冰箱過夜解凍，然后在室溫下輕輕搖勻。避免水浴快速解凍或置于37°C（溫度驟變易致沉淀）。 
輕柔操作：解凍和混勻時動作輕柔，避免劇烈搖晃或產生氣泡。 
儲存溫度恒定：長期儲存務必在-70°C至-80°C。
 
2、顏色異常處理與預防： 
輕微深黃色：如果細胞生長正常，通常可接受。但新批次建議先測試。 
粉紅色/紅色（溶血）：溶血血清可能含有高水平的游離鐵和血紅蛋白，對某些細胞有毒或影響實驗。 
渾濁：高度懷疑污染，立即停止使用并丟棄！徹底清潔相關區域。 
預防： 
選擇信譽良好、質檢嚴格的供應商。 
嚴格遵循儲存條件（-70°C至-80°C），避免在4°C長期存放（>1個月）。 
規范解凍操作（見沉淀預防）。
 
3、微生物污染處理與預防： 
一旦發現或懷疑污染（細菌、真菌）： 
立即隔離：將污染的培養物、培養基、血清、耗材等密封后高壓滅菌或浸泡消毒液。 
徹底消毒：對培養箱、超凈臺、實驗臺面、移液器等進行徹底消毒（消毒劑擦拭、紫外照射、必要時甲醛熏蒸）。 
丟棄：污染的血清必須丟棄。 
支原體污染： 
檢測確認：使用PCR或專業檢測試劑盒確認。 
處理極其困難：通常建議丟棄所有污染的細胞株、培養基和可能污染的試劑（包括該瓶血清），徹底清潔環境，啟用新的細胞株和試劑。使用支原體清除試劑處理珍貴細胞株是最后手段，但風險高且可能不徹底。 
病毒污染：檢測和處理更復雜，通常需要丟棄并徹底消毒。 
預防（重中之重！）： 
無菌操作：嚴格遵守無菌操作規程（在超凈臺內操作，使用無菌耗材，穿戴實驗服手套，酒精消毒手和臺面）。 
定期檢測：對新批次血清進行無菌測試（細菌/真菌培養）和支原體檢測（PCR或專業試劑盒）。對細胞培養物定期進行支原體檢測（如每月一次）。 
規范分裝使用：血清分裝和使用時保持無菌環境，避免將同一吸管/移液頭反復插入血清瓶中。取用后及時蓋緊瓶蓋。 
添加抗生素：在培養基中添加適當濃度的抗生素（如青霉素-鏈霉素）可抑制細菌生長，但不能替代無菌操作，且對支原體/真菌效果有限或無效。 
選擇輻照血清：伽馬輻照處理能有效滅活血清中可能存在的病毒、支原體等微生物，推薦使用，尤其用于珍貴細胞或嚴格實驗。注意輻照對血清成分可能有輕微影響。
 
4、細胞生長不良/毒性處理與預防： 
處理： 
更換血清批次：首要嘗試。選擇經質檢合格的新批次。 
血清測試：對新批次血清進行細胞生長測試（倍增時間測定）和內毒素檢測（LAL法）。選擇最適合自己細胞系的批次。 
調整濃度：嘗試降低或提高血清濃度（但常用濃度范圍是5%-20%）。 
避免滅活：除非實驗明確要求（如補體依賴實驗），盡量避免熱滅活，因為弊大于利（破壞生長因子，可能產生沉淀）。 
預防： 
嚴格供應商選擇：選擇提供詳細質檢報告（包括內毒素水平、理化指標、無菌支原體檢測、生長促進測試）的知名品牌供應商。 
索要并查看質檢報告：購買前務必索取并仔細閱讀該批次的質檢報告（CoA）。 
批次測試：對于關鍵實驗或珍貴細胞系，務必對新批次血清進行小規模細胞生長測試，合格后再大量使用。 
預留庫存：對于驗證過的好批次，盡量多購買一些同一批次的血清，分裝凍存備用。 
規范儲存與解凍：如前所述。 
關注內毒素：對于敏感細胞（干細胞、原代細胞、免疫細胞），選擇內毒素含量低的血清（如<10 EU/mL，甚至<5 EU/mL）。
 
5、批次間差異處理與預防： 
處理： 
批次測試：每次更換新批次前必須進行嚴格的細胞生長和功能測試，確保能滿足實驗要求。 
混合使用：在舊批次快用完時，提前引入新批次血清，新舊批次按比例混合使用一段時間，讓細胞逐漸適應。 
預留庫存：同上。 
預防： 
選擇來源穩定、質檢嚴格的供應商：大品牌通常能提供相對更穩定的產品。 
盡量使用同一批次：對于長期項目，一次性購買足夠量的同一批次血清。 
詳細記錄：對使用的每一瓶血清的批次號進行詳細記錄。
 
重要注意事項： 
血清驗收：新批次血清到貨后，檢查外觀（顏色、是否溶血、有無大量沉淀）、包裝完整性、標簽信息（批號、有效期、儲存條件）是否與訂單一致。核對供應商提供的質檢報告（CoA）。 
滅活的爭議：除非實驗特殊需要（如滅活補體），越來越多的證據表明熱滅活通常是不必要的，且可能有害（破壞生長因子、增加沉淀風險）。僅在明確需要時才進行滅活（56°C水浴30分鐘，期間輕輕搖動幾次）。 
血清替代物：對于某些細胞類型或特定研究目的（如研究生長因子作用、生產治療性蛋白），可考慮使用化學成分明確的無血清培養基或添加特定生長因子的血清替代物，以消除批次差異和動物源性風險。
 
總結： 
有效管理動物血清的關鍵在于：嚴格供應商選擇與質檢報告審核、規范儲存（-70°C至-80°C分裝）與解凍（2-8°C過夜）、嚴格遵守無菌操作規程、對新批次進行嚴格的細胞生長測試、避免不必要的熱滅活、警惕沉淀和顏色變化、定期檢測支原體、預留同批次庫存并做好詳細記錄。通過采取這些預防措施和及時處理問題，可以最大程度地減少血清相關問題對細胞培養實驗的影響。