細胞培養(yǎng)中動物血清的常見問題及處理方法與預(yù)防措施！

動物血清（尤其是胎牛血清，F(xiàn)BS）是細胞培養(yǎng)中不可或缺的培養(yǎng)基添加劑，提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、激素、生長因子、結(jié)合蛋白等。然而，在使用過程中會遇到各種問題。了解這些問題及其處理方法對于保證實驗的穩(wěn)定性和可重復(fù)性至關(guān)重要。
 
一、常見問題
1、沉淀/絮狀物： 
表現(xiàn)：血清解凍后出現(xiàn)白色、棕色或絮狀沉淀物，懸浮或沉于瓶底。 
原因： 
纖維蛋白/纖維蛋白原：這是最常見的原因，凝血過程中形成，尤其在反復(fù)凍融或溫度波動時析出。 
磷酸鈣：血清中鈣離子和磷酸根離子在特定條件下（如pH、溫度變化）結(jié)合形成。 
脂蛋白：血清中的脂類在低溫或長期保存時聚集。 
蛋白聚合物：血清蛋白變性或聚集。 
微粒：過濾不徹底或儲存過程中產(chǎn)生。 
影響：堵塞濾膜、影響細胞狀態(tài)（物理刺激、消耗養(yǎng)分）、影響實驗觀察（如顯微鏡下）。
 
2、顏色異常： 
表現(xiàn)： 
淡黃色/稻草黃：正常顏色。 
深黃色/琥珀色：通常由于保存時間過長或儲存溫度偏高導(dǎo)致血紅蛋白（血紅素）氧化。 
粉紅色/紅色：明顯的血紅蛋白污染（溶血），通常由于采血過程處理不當(dāng)或凍融過程劇烈導(dǎo)致紅細胞破裂。 
渾濁/云霧狀：可能指示細菌污染或高脂血清。 
影響：深色可能不影響細胞生長，但影響光學(xué)觀察。粉紅色/紅色指示溶血，可能影響某些細胞類型（如神經(jīng)元）。渾濁需警惕污染。
 
3、微生物污染： 
表現(xiàn)： 
細菌：培養(yǎng)基迅速渾濁、pH急劇下降（變黃）、鏡下可見大量活動小點。 
真菌/酵母：培養(yǎng)基中出現(xiàn)絮狀、絲狀或點狀懸浮物，pH變化，鏡下可見菌絲或孢子。 
支原體：培養(yǎng)基可能無明顯渾濁，但細胞狀態(tài)變差（生長緩慢、形態(tài)改變、易脫落、代謝異常），檢測需要特殊方法（PCR、DNA染色、培養(yǎng)法）。 
病毒：更難檢測，可能通過影響細胞表型或PCR等方法發(fā)現(xiàn)。 
原因：血清生產(chǎn)、分裝、運輸、儲存或使用過程中無菌操作不當(dāng)引入。 
影響：導(dǎo)致細胞死亡、實驗結(jié)果無效、交叉污染整個實驗室。
 
4、細胞生長不良/毒性： 
表現(xiàn)：細胞貼壁差、增殖緩慢、形態(tài)異常、死亡率高、達不到預(yù)期密度。 
原因：
血清質(zhì)量差：來源動物健康狀況差、生產(chǎn)工藝不佳、內(nèi)毒素含量高、激素/生長因子水平不足或不穩(wěn)定。 
批次差異：不同批次血清的成分（特別是生長因子、激素）存在自然差異。 
滅活處理不當(dāng)：過度滅活（溫度過高、時間過長）破壞有益成分或產(chǎn)生毒性物質(zhì)。 
污染：特別是支原體或病毒污染。 
沉淀物影響：物理刺激或消耗養(yǎng)分。 
儲存條件不當(dāng)：反復(fù)凍融、長期置于4°C或更高溫度導(dǎo)致成分降解。 
內(nèi)毒素含量高：內(nèi)毒素（LPS）對某些細胞（如免疫細胞、原代細胞、干細胞）有很強毒性。 
影響：實驗失敗，結(jié)果不可靠，時間和資源浪費。
 
5、批次間差異： 
表現(xiàn)：同一細胞系使用不同批次的血清，生長速度、形態(tài)、代謝或特定功能表達不一致。 
原因：血清是天然產(chǎn)物，其成分受動物品種、年齡、地理位置、季節(jié)、飲食、采血和加工方法等多種因素影響，無法做到完全均一。 
影響：實驗可重復(fù)性差，更換批次時需要重新優(yōu)化條件或驗證。
 
二、處理方法與預(yù)防措施
 
1、沉淀/絮狀物處理： 
輕微沉淀（常見纖維蛋白）：解凍后，溫和地將血清在2-8°C冰箱中靜置過夜，讓大部分沉淀沉底。然后小心吸取上清液使用（避免攪動沉淀）。通常不需要過濾去除，過度過濾會損失生長因子。 
大量沉淀或懷疑其他類型沉淀： 
離心：在2-8°C，以約2000-4000g離心5-10分鐘，小心吸取上清液。 
過濾：如果必須去除（例如做無血清實驗或特殊要求），使用孔徑≥0.45μm的低蛋白吸附濾膜過濾（0.22μm過濾會顯著損失有效成分）。僅在必要時進行！ 
預(yù)防： 
避免反復(fù)凍融：購買后立即分裝成小份（如50ml），儲存于-20°C（短期1-2年）或最佳為-70°C至-80°（長期保存）。 
規(guī)范解凍：從-20°C/-80°C取出后，先置于2-8°C冰箱過夜解凍，然后在室溫下輕輕搖勻。避免水浴快速解凍或置于37°C（溫度驟變易致沉淀）。 
輕柔操作：解凍和混勻時動作輕柔，避免劇烈搖晃或產(chǎn)生氣泡。 
儲存溫度恒定：長期儲存務(wù)必在-70°C至-80°C。
 
2、顏色異常處理與預(yù)防： 
輕微深黃色：如果細胞生長正常，通常可接受。但新批次建議先測試。 
粉紅色/紅色（溶血）：溶血血清可能含有高水平的游離鐵和血紅蛋白，對某些細胞有毒或影響實驗。 
渾濁：高度懷疑污染，立即停止使用并丟棄！徹底清潔相關(guān)區(qū)域。 
預(yù)防： 
選擇信譽良好、質(zhì)檢嚴格的供應(yīng)商。 
嚴格遵循儲存條件（-70°C至-80°C），避免在4°C長期存放（>1個月）。 
規(guī)范解凍操作（見沉淀預(yù)防）。
 
3、微生物污染處理與預(yù)防： 
一旦發(fā)現(xiàn)或懷疑污染（細菌、真菌）： 
立即隔離：將污染的培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、血清、耗材等密封后高壓滅菌或浸泡消毒液。 
徹底消毒：對培養(yǎng)箱、超凈臺、實驗臺面、移液器等進行徹底消毒（消毒劑擦拭、紫外照射、必要時甲醛熏蒸）。 
丟棄：污染的血清必須丟棄。 
支原體污染： 
檢測確認：使用PCR或?qū)�業(yè)檢測試劑盒確認。 
處理極其困難：通常建議丟棄所有污染的細胞株、培養(yǎng)基和可能污染的試劑（包括該瓶血清），徹底清潔環(huán)境，啟用新的細胞株和試劑。使用支原體清除試劑處理珍貴細胞株是最后手段，但風(fēng)險高且可能不徹底。 
病毒污染：檢測和處理更復(fù)雜，通常需要丟棄并徹底消毒。 
預(yù)防（重中之重！）： 
無菌操作：嚴格遵守?zé)o菌操作規(guī)程（在超凈臺內(nèi)操作，使用無菌耗材，穿戴實驗服手套，酒精消毒手和臺面）。 
定期檢測：對新批次血清進行無菌測試（細菌/真菌培養(yǎng)）和支原體檢測（PCR或?qū)�業(yè)試劑盒）。對細胞培養(yǎng)物定期進行支原體檢測（如每月一次）。 
規(guī)范分裝使用：血清分裝和使用時保持無菌環(huán)境，避免將同一吸管/移液頭反復(fù)插入血清瓶中。取用后及時蓋緊瓶蓋。 
添加抗生素：在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的抗生素（如青霉素-鏈霉素）可抑制細菌生長，但不能替代無菌操作，且對支原體/真菌效果有限或無效。 
選擇輻照血清：伽馬輻照處理能有效滅活血清中可能存在的病毒、支原體等微生物，推薦使用，尤其用于珍貴細胞或嚴格實驗。注意輻照對血清成分可能有輕微影響。
 
4、細胞生長不良/毒性處理與預(yù)防： 
處理： 
更換血清批次：首要嘗試。選擇經(jīng)質(zhì)檢合格的新批次。 
血清測試：對新批次血清進行細胞生長測試（倍增時間測定）和內(nèi)毒素檢測（LAL法）。選擇最適合自己細胞系的批次。 
調(diào)整濃度：嘗試降低或提高血清濃度（但常用濃度范圍是5%-20%）。 
避免滅活：除非實驗明確要求（如補體依賴實驗），盡量避免熱滅活，因為弊大于利（破壞生長因子，可能產(chǎn)生沉淀）。 
預(yù)防： 
嚴格供應(yīng)商選擇：選擇提供詳細質(zhì)檢報告（包括內(nèi)毒素水平、理化指標、無菌支原體檢測、生長促進測試）的知名品牌供應(yīng)商。 
索要并查看質(zhì)檢報告：購買前務(wù)必索取并仔細閱讀該批次的質(zhì)檢報告（CoA）。 
批次測試：對于關(guān)鍵實驗或珍貴細胞系，務(wù)必對新批次血清進行小規(guī)模細胞生長測試，合格后再大量使用。 
預(yù)留庫存：對于驗證過的好批次，盡量多購買一些同一批次的血清，分裝凍存?zhèn)溆谩?nbsp;
規(guī)范儲存與解凍：如前所述。 
關(guān)注內(nèi)毒素：對于敏感細胞（干細胞、原代細胞、免疫細胞），選擇內(nèi)毒素含量低的血清（如<10 EU/mL，甚至<5 EU/mL）。
 
5、批次間差異處理與預(yù)防： 
處理： 
批次測試：每次更換新批次前必須進行嚴格的細胞生長和功能測試，確保能滿足實驗要求。 
混合使用：在舊批次快用完時，提前引入新批次血清，新舊批次按比例混合使用一段時間，讓細胞逐漸適應(yīng)。 
預(yù)留庫存：同上。 
預(yù)防： 
選擇來源穩(wěn)定、質(zhì)檢嚴格的供應(yīng)商：大品牌通常能提供相對更穩(wěn)定的產(chǎn)品。 
盡量使用同一批次：對于長期項目，一次性購買足夠量的同一批次血清。 
詳細記錄：對使用的每一瓶血清的批次號進行詳細記錄。
 
重要注意事項： 
血清驗收：新批次血清到貨后，檢查外觀（顏色、是否溶血、有無大量沉淀）、包裝完整性、標簽信息（批號、有效期、儲存條件）是否與訂單一致。核對供應(yīng)商提供的質(zhì)檢報告（CoA）。 
滅活的爭議：除非實驗特殊需要（如滅活補體），越來越多的證據(jù)表明熱滅活通常是不必要的，且可能有害（破壞生長因子、增加沉淀風(fēng)險）。僅在明確需要時才進行滅活（56°C水浴30分鐘，期間輕輕搖動幾次）。 
血清替代物：對于某些細胞類型或特定研究目的（如研究生長因子作用、生產(chǎn)治療性蛋白），可考慮使用化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基或添加特定生長因子的血清替代物，以消除批次差異和動物源性風(fēng)險。
 
總結(jié)： 
有效管理動物血清的關(guān)鍵在于：嚴格供應(yīng)商選擇與質(zhì)檢報告審核、規(guī)范儲存（-70°C至-80°C分裝）與解凍（2-8°C過夜）、嚴格遵守?zé)o菌操作規(guī)程、對新批次進行嚴格的細胞生長測試、避免不必要的熱滅活、警惕沉淀和顏色變化、定期檢測支原體、預(yù)留同批次庫存并做好詳細記錄。通過采取這些預(yù)防措施和及時處理問題，可以最大程度地減少血清相關(guān)問題對細胞培養(yǎng)實驗的影響。