ArrayJet高通量生物芯片點樣儀助海洋病原微生物快速檢測方法建立

在我國沿海的甲殼類養(yǎng)殖場，一種稱為 “牛奶病” 的疫病正威脅著養(yǎng)殖戶的生計。該疾病由Hematodinium屬寄生甲藻所引發(fā)，專門侵襲三疣梭子蟹、鋸緣青蟹等經(jīng)濟甲殼類，一旦爆發(fā)便會導致宿主器官功能衰竭、大規(guī)模死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。棘手的是，這種寄生甲藻有著復雜的生命周期，既能以微孢子形式通過水體傳播，又能以滋養(yǎng)體形式在宿主體內(nèi)大量繁殖。傳統(tǒng)檢測方法主要依賴專業(yè)人員對樣本形態(tài)進行觀察，操作復雜、靈敏度低，難以實現(xiàn)快速篩查和早期預警。如何精準、高效地捕捉這種“隱形殺手”，成為甲殼類養(yǎng)殖健康發(fā)展的關(guān)鍵。

文章題目為“Establishment of CARD-FISH and Dot-ELISA Assays for Diagnosis of the Parasitic Dinoflagellate Hematodinium perezi”于2025年6月發(fā)表在Journal of Fish Diseases雜志，作者來自于中國科學院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境重點實驗室。

為了有效檢測 Hematodinium的不同生命階段，研究團隊開發(fā)了兩種檢測方法 CARD-FISH 和 Dot-ELISA，分別針對其體外微孢子和體內(nèi)滋養(yǎng)體。

CARD-FISH 檢測方法：將含有大量微孢子的海水用多聚甲醛固定，并過濾到 0.2μm濾膜上，經(jīng)瓊脂包被、乙醇脫水、HCl處理等步驟制備樣本，隨后使用5'端標記辣根過氧化物酶（HRP）的寡核苷酸探針，在特定的雜交緩沖液中，35℃下雜交 8 小時，清洗后加入混有底物的發(fā)光液，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，可清晰看到 Hematodinium微孢子的陽性信號。通過測試不同雜交時間，確定4小時為最佳時長；同時對多種藻類、細菌等進行檢測，驗證方法的特異性（如圖 1、2）。

圖1（左）.Hematodinium perezi血液菌小孢子的CARD-FISH檢測。(A)雜交1h， (B)雜交2h， (C)雜交4h， (D)雜交8h.
圖2（右）.CARD-FISH法檢測特異性。(A) H. perezi小孢子，(B) 5種藻類（Prorocentrum minimum, P. micans, Alexandrium sp., Heterosigma akashiwo and Akashiwo sanguinea）的細胞樣本，(C) 2種弧菌（副溶血性弧菌、harveyi弧菌）的細菌樣本和(D)肝原腸胞蟲的細菌樣本.

Dot-ELISA 檢測方法：識別宿主體內(nèi)的滋養(yǎng)體，采用放射免疫沉淀法提取 Hematodinium寄生蟲蛋白，與高通量抗體芯片孵育篩選特異性單克隆抗體，芯片由英國ArrayJet公司的Marathon（現(xiàn)Mecury系列）生物芯片點樣儀制備，大約80, 000種單克隆抗體被點印在硝酸纖維素膜上，最終獲得了能特異性識別 Hematodinium 滋養(yǎng)體的單克隆抗體HD6944。實驗通過觀察是否出現(xiàn)藍紫色斑點判斷是否感染，通過測試不同稀釋比例的單克隆抗體，確定 1:2000為最佳稀釋濃度；并對多種病原體進行檢測，驗證了方法的特異性（圖3、4）。

圖3（左）.單抗（HD6944）的最佳濃度用于Dot ELISA血液病檢測。(A)健康的血淋巴；(B)輕度血液病感染的血淋巴，(C)重度血液病感染的血淋巴（陽性對照），(D)無菌ddH2O（空白對照）.
圖4（右）.Dot-ELISA法的特異性驗證。(A)健康血淋巴，(B)白斑綜合征病毒，(C)感染性皮下和造血壞死病毒，(D)副溶血性弧菌，(E)哈維氏弧菌，(F)肝原腸胞蟲，(G)血細胞滋養(yǎng)體，(H)無菌ddH2O（空白對照），(I)Prorocentrum minimum, (J) Prorocentrum micans, (K) Alexandrium sp., (L) akashiwo Heterosigma akashiwo sanguinea.

該研究成功建立的 CARD-FISH 和 Dot-ELISA 兩種檢測方法，填補了 Hematodinium不同生命階段檢測技術(shù)的空白。CARD-FISH可有效監(jiān)測水體中的微孢子，為阻斷傳播路徑提供了依據(jù)；Dot-ELISA 操作簡便、結(jié)果直觀，適合在養(yǎng)殖場等現(xiàn)場快速檢測，能及時發(fā)現(xiàn)感染個體，有助于早期防控。同時為 Hematodinium 疫情的預防和控制提供了強有力的技術(shù)支持，有助于減少甲殼類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟損失，保障產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，對我國沿海地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要的現(xiàn)實意義。

原文鏈接：https://doi.org/10.1111/jfd.70007

Arrayjet位于英國愛丁堡，專注于提供生物芯片應用領(lǐng)域的解決方案及服務。自2000年公司成立即致力于開發(fā)新型生物樣品噴點方案–噴墨式液體處理平臺，該系統(tǒng)于2006年上市，目前用戶遍布全球27個國家。

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