SPRi表面等離子共振技術助力發現靶向生物膜結構的多糖靶點

生物膜由附著在兩個表面和彼此間的微生物細胞和胞外聚合物（EPSs，如胞外 DNA、胞外多糖、蛋白質等生物分子）構成，能保護病原體免受免疫反應和傳統抗生素治療的影響，產生耐藥性。目前，80% 的細菌和真菌感染與生物膜形成有關，使得生物膜相關疾病的治療面臨巨大挑戰。多糖胞間粘附素（PIA）是多種微生物產生的關鍵生物膜成分，最初以N - 乙酰化的聚 - β - 1,6 - N - 乙酰葡糖胺（PNAG）生物形式合成，經脫乙酰化形成成熟的胞外多糖。脫乙酰化對于維持PIA的正常功能、表面附著和生物膜形成至關重要，例如在表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌中，IcaB 蛋白對 PNAG 脫乙酰化是形成堅固且具有毒性的PIA相關生物膜的前提條件。由于缺乏研究PIA的有效試劑和技術，對PIA多糖鏈中脫乙酰化的程度、位置和方式都尚不明確。盡管針對 PIA 的研究有一定進展，如抗 PNAG 單克隆抗體 F598 已進入二期臨床，對多種致病性微生物有強結合能力，在動物模型中也顯示出一定療效，且合成的脫乙酰化PNAG在疫苗開發方面表現出明顯優勢，但這些成果仍無法滿足臨床需求。

文章題目為“Insights into biofilm architecture and maturation enable improved clinical strategies for exopolysaccharide-targeting therapeutics”于2024年12月發表在Cell Chemical Biology雜志，作者來自美國國家癌癥研究所化學生物學實驗室。

該團隊使用生物芯片點樣儀將873種不同的糖復合物（PNAG、糖蛋白、糖肽、糖脂、聚糖等）點印在PolyAn 2D環氧修飾的功能化玻片上，并使用125 - 200μg/mL的單克隆抗體TG10和F598孵育，隨后使用Cy3標記的熒光二抗結合，結果采用Innopsys熒光掃描儀進行統計分析，數據顯示抗體有良好的選擇性，僅對PNAG有相互作用。在對PNAG多糖序列設計時，主要針對5個不同的PNAG乙酰化位點，數字1代表乙酰化，0代表去乙酰化，發現抗體TG10主要結合去乙酰化PNAG、抗體F598主要結合乙酰化PNAG，如圖1

圖1：根據乙酰化程度帶電荷的不同設計出32種不同PNAG，其與抗體結合后的熒光結果統計圖

繼而對抗體的結合動力學進行分析，使用芯片點樣儀將59種聚糖樣品和對照（濃度為1mg/mL的PBS溶液）打印到Plexera SPRi芯片表面。點印區域14mm×14mm，樣品重復打印4次，形成一個15×16的微陣列。打印完成后，芯片在真空環境下避光干燥過夜，然后用 365nm UV光照射15分鐘進行光交聯。交聯后，用PBS和去離子水對芯片進行清洗，之后將其組裝到流動池中，并放入儀器中進行測試。以1xPBS含1% BSA作為運行緩沖液，調整SPRi的光學位置，待基線穩定后開始結合實驗。將抗體注入流動池，設定250秒的結合時間和600秒的解離時間，流速為2mL/s。使用甘氨酸-HCl（10mM, pH2.0）作為再生緩沖液。為了獲得完整的滴定曲線，使用稀釋法將抗體濃度設定在100nM 至0.78nM的范圍內進行檢測。結果使用Plexera SPR Data Analysis 軟件（Plexera）和 GraphPad Prism 10 （Dotmatics）進行分析，發現TG10和PNAG（00000）之間的KD值為9.7±0.6 nM，如圖2。

圖2：PlexArray HT儀器采用SPRi方法進行動態結合動力學過程分析，給不同濃度的TG10進行結合檢測，發現隨著劑量與結合的去乙酰化PNAG成正比（圖C），給予定量100 nM TG10與32種不同的PNAG動力學檢測（圖D），不同濃度的TG10與去乙酰化PNAG (00000) 的結合效果（圖E）

研究結果發現，生物膜內 PIA 存在高度乙酰化和脫乙酰化的不同區域，且這些區域在生物膜成熟過程中呈現動態變化，且能特異性結合高度脫乙酰化PNAG的單克隆抗體 TG10，與臨床二期試驗中的 F598 抗體結合特性互補，分別識別生物膜中不同乙酰化狀態的PIA區域。研究深化了對PIA結構和成熟過程的理解，為開發靶向PIA的治療藥物、完善疫苗和診斷試劑的設計提供了重要依據。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2024.11.005

Arrayjet位于英國愛丁堡，專注于提供生物芯片應用領域的解決方案及服務。Mercury系列微量-皮升級／納升級點樣儀產品采用獨特的飛行噴墨點樣技術實現行業第一的快速、非接觸式微量液體處理。同時上萬種不同樣品可以進行快速點樣，更低的上樣體積可有效減少樣品損失，使您的珍貴樣品物盡其用。

Innopsys 成立于1999年。總部位于法國，一直致力于生物醫學領域相關儀器和軟件的自主研發和生產。Innoscan系列掃描儀，采用先進的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時進行多通道熒光檢測。在基因組和蛋白組表達，腫瘤特異性標志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應用。

普芯生物，源于美國Lumera（2003年成立）生物檢測部，2009年Plexera 成立，致力于研發無標記高通量SPRi系統和芯片藥物篩選技術，2018年推出第一代PlexArray HT 并不斷迭代，2023底年正式推出由蘇州普芯在國內自主研發、國內硬件生產和組裝同時重新設計軟件系統的PlexArray HT Ultra系列。

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