FIDA在確定ReS19-T與阿爾茲海默癥治療新靶點作用機制中的應用

研究背景：利用FIDA確定ReS19-T與阿爾茲海默癥治療新靶點作用機制
異常鈣信號是阿爾茨海默病（AD）的核心病理組成部分。本研究篩選出了ReS19-T的化合物，它能夠在基于細胞的tau病理模型中恢復鈣穩態。異常的tau積累導致通過重塑細胞皮質的septin絲體不受控制地激活儲存操作鈣通道（SOCCs）。ReS19-T與septin結合，可以在疾病狀態下恢復絲體的組裝，并抑制SOCCs的鈣離子進入。在由淀粉樣β和tau驅動的小鼠疾病模型中，ReS19-T藥物恢復突觸可塑性，使腦網絡活動正常化，并減輕淀粉樣蛋白β和tau病理的發展。研究結果確定了septin細胞骨架是開發疾病修飾性AD治療的潛在治療靶點。
 

FIDA技術的關鍵作用
這項研究中，層流誘導分散分析（FIDA）技術發揮了至關重要的作用。文章中，由于septin蛋白容易聚集，導致常規互作技術無法得到有效數據，FIDA技術采用無需標記和無需固定的方式，完全的In-solution Labelfree，解決了蛋白因為固定或標記導致的分子結構與功能的異常的問題，而且FIDA通過同步的粒徑（Rh）與構象（BRIC）分析對親和力進行了兩維表征。利用FIDA，研究人員精確測量了ReS19-T化合物與無標記的septin 6絲狀蛋白的高親和力結合，揭示了通過ReS19-T與septin 6的結合來恢復septin絲狀結構的完整性，進而防止了病理狀態下SOCCs的異常激活，這對于理解ReS19-T的藥理作用機制至關重要。
 

研究思路
通過篩選內部化合物庫識別出具有保護作用的化合物ReS19-T，并進行三雜交確定SEPT6為待選高親和力靶點

通過開發細胞基礎篩選測定，模擬tau和鈣引起的神經毒性，篩選內部化合物庫，發現了具有保護作用的化合物ReS19-T及其衍生物。研究表明，REM127是最有效的化合物，能夠降低細胞內鈣濃度并對抗tau和淀粉樣蛋白引起的神經毒性。此外，SEPT6被確定為ReS19-T的主要靶點，與ReS19-T有較強的結合能力，可能與tau及細胞骨架的關系密切。
 

圖1通過多輪篩選確定REM127（ReS19-T），是該系列中最有效的化合物，降低毒性和[Ca2+]細胞，中位有效濃度（ec50）分別為15和19 nM（圖1A），但對tau表達或atra依賴的基因轉錄沒有影響（C和D）
 

圖2，胞內相互作用，不同septin亞型的MFC （REM929 - linked to甲氨蝶呤）（N = 3，誤差條表示SD）。插圖顯示了在三雜交實驗中探測到的septin同種異構體的系統發育分析

利用FIDA labelfree確定REM127（ReS19-T）與純化的septin同種型的結合親和力
文章中檢測了小分子REM127（ReS19-T）與純化的septin同種型的結合，使用層流誘導分散分析（FIDA），無標記和無固定化的通過測量水動力學半徑大小（Rh）和構象（BRIC）的變化來量化生物分子相互作用。在這些實驗中，septin同種型在高鹽條件下維持，以防止聚集。REM127誘導了SEPT6的水動力半徑（Rh）的濃度依賴性增加，當將其擬合到結合曲線時，計算出表觀解離常數（Kd_app）為1.5 nM。基于構象的結合相關熒光強度變化（BRIC）測量Kd_app也得到了相近的值1.6 nM（圖3A，D）。

對于SEPT7和SEPT2未檢測到化合物誘導的水動力半徑變化。這些體外結合研究表明REM127直接與SEPT6高親和力結合，并可能影響靶點構象。研究還提供了REM127與SEPT7和SEPT2之間較弱結合的證據。
 

圖3 REM127與SEPT6的親和力曲線，（A）水動力學半徑（Rh）擬合的親和力曲線（D）BRIC擬合的親和力曲線（B）(C)分別為REM127與SEPT7和SEPT2之間親和力曲線

在驗證REM127與SEPT6具有高親和力后進一步探討其在調節SOCE和鈣穩態中的作用

SEPT6的沉默會降低REM127對毒性和細胞內鈣濃度的抑制作用，表明SEPT6在藥效中的重要性。tauP301L顯著增加細胞內鈣濃度和SOCE的振幅，而REM127能夠恢復這些指標至正常水平。SOCE在tauP301L狀態下被激活，導致細胞內鈣過載，并可通過靶向SEPT6或抑制SOC通道來緩解毒性。所以REM127通過抑制tau誘導的SOCE及其對SEPT6的高親和力結合，恢復鈣穩態，從而有望作為治療阿爾茨海默病的候選藥物。

圖4，tauP301L顯著增加細胞內鈣濃度和SOCE的振幅REM127能夠恢復這些指標

ReS19-T調節septin可恢復患者源性iPSC神經元和AD小鼠模型的網絡功能并減輕AD病理發展

在表達人tauP301S（一種引起FTD的突變）或攜帶AD家族突變V717I （APP- ln）的APP London突變的轉基因小鼠中，研究了REM127對突觸可塑性的影響。兩種神經退行性變模型均顯示海馬CA1區長期增強（LTP）的嚴重缺陷（圖C和D），這是一種與學習和記憶相關的突觸效能的活性和鈣依賴性增加形式。口服REM127可恢復tauP301S和APP-Ln小鼠的LTP（圖C和D）。用該化合物治療7天足以恢復APP-Ln小鼠的LTP（圖D）
 

圖5（C）WT和tauP301S小鼠（3.5月齡，每組N = 8）給予載藥或REM127 （20 mg/kg/天）2個月CA1 LTP。箭頭表示LTP誘導刺激。(D) WT/Veh （N = 5）、APP-Ln/Veh （N = 8）和APP-Ln/REM127 （N = 6）小鼠（7月齡）灌胃或REM127 （20 mg/kg/天）7 D后CA1 LTP的變化

除了介導神經元變性外，異常鈣信號被認為促進了AD病理的發展。因此，我們假設通過ReS19-T抑制病變神經元中的鈣內流可以減輕AD小鼠模型的病理。雙源性APP-Ln的治療：PS1（A246E）用REM127治療3個月后，新皮質（圖7）和托下（連接內鼻皮層和海馬體的結構）中的Ab斑塊堆積減少了55%至60%。這兩個大腦區域都很突出。
 

圖6（A至D） APP-Ln:PS1（A246E）小鼠3個月后給藥（N = 16）或口服REM127 (N = 12)，劑量為20mg /kg/天。（A至C）抗淀粉樣蛋白原纖維染色的Ab斑塊皮質[(A)和(B)]和托骨下[(A)和(C)]的LOC抗體。(D)皮層CD11b免疫反應性

FIDA的技術優勢

1. 無需標記和固定：對于大多數小分子與蛋白互作實驗可以通過FIDA的280nm光學模塊無標記的Labelfree方式檢測，FIDA技術無需固定、無需加熱，無需標記。

2. 數據QC與正交驗證：FIDA技術提供的是第一性原理的水動力學絕對值檢測，因此數據準確可靠。可同步構象改變(BRIC)進行正交親和力驗證。并可在實驗的全流程進行樣品的8個關鍵質量參數的質控。

3. 靈敏度高：FIDA技術的靈敏度極高，并能夠檢測到小于1%的Rh變化，這對于評估小分子藥物的結合親和力等參數非常有用。

4. 樣品消耗少：本實驗中 SEPT7 濃度為6 uM，單次檢測只需要40nL，只需要極少量的蛋白樣品，分析物（REM127）從0-250nM完成滴定。