使用G418篩選 293T細胞操作介紹

   在細胞培養實驗中，293T細胞是一種常用的工具細胞，廣泛應用于基因表達、病毒包裝等領域。G418是一種常用的篩選抗生素，用于篩選帶有新霉素抗性基因的細胞。那么， 293T細胞用G418篩選的濃度是多少？在操作過程中需要注意哪些事項呢？本文將為您詳細解答。

一、G418篩選293T細胞的工作原理
G418是一種新霉素類抗生素，通過干擾細胞內蛋白質的合成，從而導致細胞死亡。但是，帶有新霉素抗性基因的細胞可以產生抗性蛋白，從而抵抗G418的毒性。因此，在含有G418的培養基中，只有帶有新霉素抗性基因的細胞能夠存活和生長。

二、G418濃度對293T細胞的影響
G418濃度對293T細胞的影響是多方面的，包括細胞生長、細胞活力、細胞形態和細胞抗性等方面。G418濃度對293T細胞的具體影響主要表現在以下幾個方面：
1.細胞生長：在較低的G418濃度下（如0.25 mg/ml），293T細胞能夠正常生長，細胞密度逐漸增加，形態保持良好。隨著G418濃度的增加（如0.5 mg/ml），細胞生長速度開始減慢，細胞密度增加緩慢。當G418濃度達到1 mg/ml時，部分細胞開始死亡，細胞密度明顯下降。繼續增加G418濃度（如2 mg/ml），細胞死亡更加嚴重，細胞密度降低。
2.細胞活力：G418濃度越高，細胞活力越低。在低濃度G418（如0.25 mg/ml）下，細胞活力較高，細胞形態飽滿，染色均勻。隨著G418濃度的增加，細胞活力逐漸下降，細胞形態變得不規則，染色不均勻。在高濃度G418（如2 mg/ml）下，細胞活力低，細胞形態嚴重受損，染色異常。
3.細胞形態：G418濃度越高，細胞形態越不規則。在低濃度G418下，細胞形態飽滿，呈梭形或扁平形。隨著G418濃度的增加，細胞形態變得不規則，細胞體積縮小，細胞邊緣不清晰。在高濃度G418下，細胞形態嚴重受損，細胞體積極小，細胞邊緣破碎。
4.細胞抗性：G418濃度越高，細胞抗性越強。在低濃度G418下，細胞對G418的敏感性較高，細胞容易死亡。隨著G418濃度的增加，細胞逐漸產生抗性，細胞存活率提高。在高濃度G418下，細胞抗性達到頂點，細胞能夠抵抗高濃度的G418毒性。
所以，對于293T細胞，G418的篩選濃度通常在1-2 mg/ml之間。這個濃度可以根據實驗需求進行調整。一般來說，篩選濃度越高，篩選效果越好，但同時也會對細胞造成一定的損傷。因此，在選擇篩選濃度時，需要根據實驗目的和細胞耐受性進行權衡。在實際操作中，可以先從較低濃度開始，如0.5 mg/ml，觀察細胞生長情況，逐漸增加濃度，直到找到合適的篩選濃度。

三、293T細胞篩選步驟：
1. 篩選前準備：在篩選前，需要將293T細胞接種到含有G418的培養基中。為了提高篩選效率，可以先將細胞接種到含有較低濃度G418的培養基中，然后逐漸提高濃度。此外，可以預先在培養基中加入適量的抗生素，如慶大霉素或卡那霉素，以防止污染。
2. 篩選過程：在含有G418的培養基中，細胞可能會出現不同程度的損傷。為了減輕細胞損傷，可以適當降低培養基中的血清濃度，或者添加一些細胞保護劑，如谷氨酰胺、雙抗等。此外，保持培養基的pH值在適宜范圍內，一般為7.2-7.4，有利于細胞生長。
3. 篩選時間：G418篩選的時間可以根據細胞生長情況來決定。一般來說，篩選時間為3-7天。在篩選過程中，需要定期觀察細胞生長情況，如細胞形態、密度等。如果發現細胞生長不良，可以適當降低G418濃度，或者延長篩選時間。
4. 篩選后處理：在篩選完成后，需要將抗性細胞進行擴大培養。為了提高細胞純度，可以對細胞進行多次傳代和篩選。在傳代過程中，需要定期觀察細胞生長情況，如細胞形態、密度等。如果發現細胞生長不良，可以適當降低G418濃度，或者延長篩選時間。此外，在傳代過程中，可以定期更換培養基，以清除殘留的G418。

四、293T細胞篩選注意事項：
1. 在操作過程中，要嚴格遵守無菌操作規程，防止污染。
2. 注意培養基的配制，確保無菌無毒。
3. 定期檢查培養箱的溫度和濕度，保持適宜的培養環境。
4. 觀察細胞生長情況，及時處理異常情況。
5. 做好實驗記錄，便于后續分析和總結。

總之，293T細胞用G418篩選的濃度通常在1-2 mg/ml之間，具體濃度需要根據實驗需求進行調整。在操作過程中，需要注意篩選前準備、篩選過程、篩選時間以及篩選后處理等方面。通過合理的篩選條件和方法，可以獲得高純度的抗性細胞，為后續實驗提供良好的基礎。同時，要注意操作過程中的注意事項，確保實驗的順利進行。