熒光定量PCR實驗方法和應用介紹

        實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

       在常做的QPCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

在Real-timePCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和絕對定量。
 
         相對定量是用于測定兩個或多個不同樣品中靶基因量的差異，得到的數據是目的基因在各樣本中含量的相對比例。即將實驗樣本中靶基因的Ct值與對照樣本的Ct值進行比較，結果用實驗樣本中靶基因量與對照樣本中靶基因量的比值或差異倍數來表示。該方法在qPCR定量檢測RNA水平中最常見，研究生理變化對基因表達水平的影響。

        絕對定量常用于精確計算初始模板中目的基因的濃度，比如測定血液樣品中病毒顆粒數（DNA或RNA）,細胞中基因的拷貝數等，得到的數據是單個樣本的定量描述，不依賴于其他樣本。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數的對數存在線性關系，這種關系表現為標準曲線，絕對定量的檢測即根據標準曲線對未知樣品進行的定量。



一、實驗方法
1.RNA提取
（1）目前最常用的RNA提取方法就是trizol法，具有極強的裂解能力，可以在短時間內充分裂解細胞或者組織樣本，保持RNA的完整性，有效抑制RNA的降解；目前市面上還有很多成品的常用RNA提取試劑盒，均是如此原理。
2.具體步驟
（1）拿出凍存組織或者新鮮組織，稱重，充分液氮研磨；
（2）加入1ml trizol或者其他成品裂解液，充分混勻后放置震蕩搖勻上5-10min，使樣本充分裂解；
（3）4℃，13000rpm離心5min后，吸取上清轉移至新1.5ml離心管中；
（4）加入預冷氯仿后，迅速劇烈震蕩30s-60s，靜置5-10min后，4℃離心；
（5）此時離心管中液體分為三層，吸取最上層水溶液轉移新離心管中；
（6）加入等體積異丙醇，充分混勻后，靜置5-10min后，4℃離心；
（7）棄上清，對管底白色沉淀加入預冷75%乙醇，混勻清洗后，4℃離心，棄上清；
（8）吹干沉淀后，加入DEPC水溶液，測濃度，-80攝氏度保存。
3.RNA濃度測量
一般使用nanodrop就可以測量，觀察260/280在1.8-2即可；此外也可以進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現明顯拖帶RNA可能降解；
4.反轉錄
（1）RNA自身是無法作為PCR反應的模板的，需要先將其反轉錄為cDNA，在進行QPCR檢測；
（2）通常根據RNA濃度，每個樣本量取固定3ug/5ug的RNA進行反轉錄，加入反轉錄試劑盒中配套的試劑，在固定溫度進行；得到的cDNA稀釋同倍數后，-80℃保存。
5.實時熒光定量PCR檢測
（1）常規認為相同RNA的量進行的反轉錄，得到的cDNA不需要調整濃度，在上機檢測PCR時取相同體積cDNA進行，一般取2-4ul均可。



（2）如果是做絕對定量，則上述需要增加標準品即可；如果是做常規mRNA，內參插管選擇actin或者GAPDH即可；若檢測的是特殊的micRNA等，內參常規使用U6。
（3）常見案例