脂肪間充質干細胞ADSCs的介紹與其分離培養的詳細步驟

在普遍的認知中，大多數人會把脂肪當作身體中一種不受歡迎的物質，甚至與“肥胖”劃等號。隨著物質生活水平的提高，人體內攝入的卡路里越來越多，也就容易造成了肥胖。肥胖不僅影響形體的美觀，而且容易引發人體諸多疾病，世界衛生組織（WHO）已將肥胖定義為慢性疾病。

其實，我們不必“談脂色變”，適量的脂肪是人體不可或缺的營養元素之一，除了為人體提供熱量，它還承擔著保護內臟、影響內分泌、抵御寒冷等多種功能。你或許還不知道，脂肪組織中還蘊藏著神秘又寶藏的黃金資源——脂肪間充質干細胞，今天就帶你重新認識她。
 

ADSCs是什么？

脂肪間充質干細胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs），與其他種類的干細胞家族成員一樣具有強大的自我復制和多向分化潛能。作為一種成體干細胞，試想每個哺乳動物身上都擁有脂肪組織，而且脂肪組織來源的脂肪間充質干細胞密度是骨髓中骨髓間充質干細胞的500倍。那這個干細胞來源是不是很容易獲取、很豐富呢？另外，較其他種類間充質干細胞，脂肪間充質干細胞具有更強的旁分泌作用，在醫美美容相關的填充和修復應用中發揮了積極作用。
 

脂肪組織結構及其衍生物

ADSCs分離培養

了解了脂肪間充質干細胞的故事，接下來我們一起來學習成人脂肪間充質干細胞分離提取、傳代培養的全過程。

材料準備
樣本：健康成人的脂肪組織≥10mL, 采集時間≤48h，運輸保存溫度4℃。

試劑：OriCell^®PBS 100mL、OriCell^®成人脂肪間充質干細胞完全培養基50mL、OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型膠原蛋白酶。

耗材：50mL無菌采集瓶一個、50mL離心管5-10個、10mL移液管4個、T75培養瓶若干個、T175培養瓶若干個、100μm細胞濾網1個。

脂肪清洗及膠原酶消化

1.1 生物安全柜內打開脂肪采集瓶，將采集瓶內的脂肪轉移至T175培養瓶中，加入OriCell^®PBS。脂肪和OriCell^®PBS的體積比為1:2，擰緊蓋子，劇烈晃動3min以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3-5min，使不同相分離，吸去下層水相；重復以上操作，直至下層液較為清澈。

1.2 向T175培養瓶中加入體積比為1:2的新配制（提前半小時預熱）的125U/mL的OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型膠原蛋白酶溶液，封口膜封口，劇烈晃動離心管5~10秒，置于水浴振蕩器中，37℃，150rpm消化30min。

分離基質血管組分（SVF）
1.3 將消化后的組織液，室溫900×g，離心10min，得到的沉淀即為SVF（Stromal Vascular Fraction）。

1.4 用移液管自上而下小心除去上層油脂和下層的膠原酶溶液。在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動沉淀細胞。

洗滌基質血管組分（SVF）
1.5 SVF沉淀中加適量OriCell^®PBS重懸細胞，吹散。室溫300×g，10min離心。

1.6 離心完后，小心吸去上清液。吸取時移液管頭應該置于離心管的上部以便于徹底的出去油脂。

1.7 再向SVF沉淀中加入40mL的OriCell^®PBS重懸細胞。

1.8 100μm細胞濾網過濾細胞懸液到新的50mL的離心管中，去除未消化的纖維組織和其他雜質。

1.9 過濾后的細胞懸液吹勻，室溫250×g，6min離心。

原代接種
2.0 離心后，用移液管吸取并去掉上清液。

2.1 用OriCell^®成人脂肪間充質干細胞完全培養基重懸離心管中的細胞，接種T75培養瓶中，補足培養基到10mL/瓶。

2.2 將培養瓶放入培養箱中37℃，5%CO₂條件培養。

換液操作
2.3 原代接種第二天進行第一次半量換液。

2.4 輕輕將培養瓶中的培養基倒入50mL離心管中，500×g，6min離心。

2.5 T75培養瓶中加入離心完畢的5mL舊培養基，5mL新OriCell^®成人脂肪間充質干細胞完全培養基，半量換液完畢。

2.6 將培養瓶放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養箱中。

2.7 完成第一次換液后，每隔3天進行一次半量換液(可以根據生長情況適當調整)。

傳代培養
（P0傳P1與P1后傳代的操作方法流程一致）
2.8 將完全培養基、PBS、胰酶預熱至37℃。

2.9 吸去培養容器中的培養基。用OriCell^®PBS(T25培養瓶加入約3mL，T75培養瓶加入約6mL)洗滌細胞2次，注意動作輕柔，清洗全面。吸去PBS。

3.0 加入胰酶(T25培養瓶加入約1.5mL，T75培養瓶加入約3mL)，迅速鋪勻，保證充分接觸細胞表面。

3.1 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓后，輕拍培養容器外壁，使細胞脫離培養表面。立即加入完全培養基(T25培養瓶加入約3mL，T75培養瓶加入約6mL)，隨即輕搖培養容器，使培養基和胰酶迅速混勻，終止消化。

3.2 使用吸管或移液管吸取細胞懸液，吹打培養容器底面數次，盡可能將細胞都吹打下來。

注意：吹打動作不可劇烈，避免產生大量氣泡，否則可能損傷和損失細胞。

3.3. 將細胞懸液轉移至離心管中。用OriCell^®PBS(T25培養瓶加入約3mL，T75培養瓶加入約6mL)洗滌容器1次，收集殘留細胞。

3.4. 收集的所有細胞懸液以250×g，離心4min。

3.5. 離心后去除上清。加入2mL完全培養基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻。將細胞按(2.5~4)×10⁴個活細胞/cm² 接種至適宜的培養容器內。

注意：培養脂肪間充質干細胞對于細胞密度有較高的要求，我們建議有條件且計數效率較高的情況下，進行手工計數，以期獲得精準的細胞濃度指導接種;在沒有精確計數條件的情況下，按照適宜比例傳代是更好的方法。通常脂肪間充質干細胞傳代比例為1:3，72h內生長至可傳代匯合度。請根據細胞實際生長情況調整傳代比例。

3.6. 搖勻細胞，放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養箱中。

3.7. 傳代次日，觀察細胞狀態。若發現較多漂浮細胞，應予以換液。待細胞生長至90%匯合，即需傳代或凍存。