百變細胞療法之CAR-NK篇：為什么CAR-NK細胞得以異軍突起

一、相關背景
在講述CAR-NK細胞的故事之前，我們先談談前些年名氣更大的CAR-T細胞。

何為CAR-T細胞？此CAR非彼CAR（汽車），此CAR全名叫做Chimeric Antigen Receptor，譯為嵌合抗原受體，其結構包含胞外結構域、跨膜區和胞內信號結構域，胞外結構域包含靶向識別腫瘤靶抗原的抗體單鏈可變區（VH-linker-VL，scFv）、鉸鏈區；胞內信號結構域是由協同共刺激分子（CD28或者4-1BB）和CD3ζ信號結構域組成。CAR-T細胞即為用CAR武裝的T細胞，CAR分子的scFv段能夠賦予T細胞靶向性，胞內信號域作為T細胞的動力引擎能夠賦予T細胞強勁的活化動力。因此相比于T細胞，CAR-T細胞的戰斗力顯著增強。

CAR-T細胞作為過繼性免疫治療領域的明星，目前已經有七個兄弟姐妹奔波于地球各個角落行使消滅癌細胞的重要使命。但是CAR-T細胞并非十全十美：首先它是一個高度定制化的抗癌武器，而且應用戰場也非常局限——只能用于患者自體的治療，導致它的制備難度高，難以實現批量生產；其次，CAR-T細胞作為極強的抗癌武器，在Kill癌細胞的同時自身也會“發熱”，在戰場上出大汗（釋放大量細胞因子），造成嚴重的損害（細胞因子風暴）；再者，CAR-T細胞是一類靶向性極高的武器，但在靶點選擇不合適的時候，也會誤打到非打擊目標（正常的組織和器官），造成平民傷亡（脫靶毒性）。

為了克服CAR-T細胞的這些缺陷，目前不少研究者都在嘗試不同的方法，例如對T細胞做些小手術，敲除其表面的TCR和CD52等限制其應用場景的部件（避免GVHD），實現產業化生產，拓寬其應用范圍（用于異體治療）。與此同時，一些研究者也把研究目光聚焦到了T細胞的其他兄弟姐妹身上，NK細胞就是其中最受矚目的。

二、NK細胞
NK細胞大名叫作自然殺傷細胞（Nature killer cell），是1957年發現的人體的固有免疫細胞，占外周單核細胞的10%左右，是抗擊外敵入侵的一重要武裝力量——在抗擊病毒感染、監視和消滅腫瘤方面具有重要作用。NK細胞的作戰范圍更廣（可用于異體治療），同時其Kill外敵時不需要像T細胞一樣做繁瑣的準備，時刻保持警惕狀態，隨時可以上場殺敵。NK細胞自身帶有精確的識別敵我的區分系統，其表面表達有多種受體，按功能可分為兩大類，即活化受體和抑制性受體。NK細胞的備戰狀態可以通過這些受體的配體的相互作用而精確調控。

NK細胞主要通過三類武器來抗擊腫瘤細胞：
❖通過釋放含有穿孔素和顆粒酶的細胞質顆粒直接殺傷靶細胞；
❖釋放細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，通過與腫瘤細胞表面相應受體的相互作用誘導腫瘤細胞凋亡；
❖Fc受體CD16與抗體的Fc段結合，可激發抗體依賴的細胞介導的細胞毒性（ADCC）來殺傷細胞。

因此，NK細胞也是抗擊腫瘤這個惡魔的一把重要利器，只要對NK細胞像T細胞裝載“一輛CAR”，也能夠極大的增強其抗擊腫瘤的戰斗力，同時它也有望克服CAR-T細胞的諸多缺陷。

三、CAR分子設計的異同
到目前為止，多數CAR-NK細胞研究中用到的CAR分子結構都是為CAR-T細胞所設計的，這類CAR分子在NK細胞也可以發揮作用，但不少研究者仍在致力于進一步設計和優化更適合NK細胞的CAR分子。表1匯總了目前CAR-NK細胞研究中用的最常用的CAR分子結構。有研究表明，相比于包含CD28/4-1BB共刺激分子的CAR，表達有共刺激分子為2B4（NK細胞特異性的共刺激信號）CAR的NK細胞具有更強的增殖能力、細胞因子分泌能力和抗腫瘤活性，說明NK特異性的共刺激信號分子在增強CAR-NK性能中具有重要的作用。相信隨著基于NK細胞的更定制的CAR分子結構的不斷演進，CAR-NK細胞的抗癌戰斗力也會不斷的提升。
 

表1 目前研究中常用的CAR分子結構^[1]

四、CAR-NK細胞的制備
不同于T細胞，NK細胞用于異體治療時候引起GvHD的風險極低，因此CAR-NK細胞有望成為能夠用于異體治療的現貨型產品。同時，這一特性也大大拓展了NK細胞的來源。如圖1所示，已經有多個來源的NK細胞都能夠實現臨床級別的制備，包括來源于外周血（PB)、臍帶血（UCB）、誘導多能干細胞（iPSC）以及NK細胞系NK-92。

目前，人外周單核細胞（PBMC）是最主要的NK細胞來源，通過NK細胞分選試劑盒可以輕松獲得高純度NK細胞，進而實現臨床級別的NK細胞制備。外周來源NK細胞制備的CAR-NK細胞通常會以CD56^dimCD16⁺NK細胞為主，其占比可達到90%以上，這一類NK細胞具有較強的毒性作用，但其增殖能力較弱。臍帶血也是NK細胞的一個重要來源，同PB來源的NK細胞一樣，臍帶血中的NK細胞也可以通過分選富集。

與PB來源的NK細胞不同，UCB來源的NK細胞多表現出不成熟的表型和較低的細胞毒性。但無論是PB還是UCB來源的CAR-NK細胞，其來源都不均一，導致其難以實現標準化。iPSC誘導來源的NK細胞有望解決UCB和PB來源NK難以標準化這一缺陷。iPSC具有無限傳代特性和基因可編輯性，能夠實現CAR-iPSC的制備，而CAR-iPSC可作為一個穩定的來源，持續不斷地制備高度均一的CAR-NK細胞。iPSC誘導的NK細胞同UCB來源的NK細胞具有相似的免疫表型，都是以不成熟的NK細胞為主。
 

圖1 NK細胞來源及不同CAR-NK制備工藝^[1]

五、CAR-NK細胞的研究進展
目前尚未有CAR-NK細胞治療產品上市，而且相比于CAR-T細胞的臨床研究數量，CAR-NK細胞的研究仍處于起步階段。但近年來有關CAR-NK細胞治療研究的報道也越來越多，不少企業都在CAR-NK細胞治療的賽道上積極布局。通過從在clinicaltrials.gov檢索CAR-NK，我們發現目前有35項在開展或已經終止的CAR-NK細胞臨床實驗，多數都是處于Phase1/2的研究階段。

就靶點分布而言，血液腫瘤主要集中在CD19（10項，包含一項雙靶點）、BCMA（3項）、CD33（2項）、CD22（2項，包含一項雙靶點）；實體腫瘤的治療靶點主要有：NKG2D（4項）、ROBO1（3項）、間皮素（1項）、PSMA（1項）。

就研究地理分布而言，目前開展臨床實驗最多的是中國，其次是美國，再就是其他國家與地區，如圖2所示。

就療效而言，CAR-NK細胞的治療效果在一些臨床前和臨床研究中已經得到初步驗證：在一項靶向CD19的CAR-NK臨床實驗中，11名接受治療的腫瘤患者中有7名患者獲得了完全緩解，而且治療過程中均未出現CRS和神經毒性等副作用，展示出NK細胞良好的應用前景。
 

圖2 CAR-NK臨床研究數量分布圖

六、總結
相比于T細胞，NK細胞具有獨特的作用機制，其發揮免疫作用時不需要預活化，且對把目標的識別不受MHC分子限制，因此NK細胞適合于異體治療。另外，CAR-NK細胞治療的毒副作用較弱，通常情況下不會產生與CAR-T細胞類似的嚴重的CRS以及神經毒性作用。但CAR-NK細胞療法也面臨著一些挑戰，比如NK細胞的增殖和純度、CAR基因遞送工具的選擇以及遞送效率等。但是，對于CAR-NK的研究目前還處于初始階段，相信隨著研究的不斷深入，這些問題終會被一一解決，CAR-NK細胞療法也會在腫瘤治療領域取得革命性進展。

參考文獻：
[1]Xie G, Dong H, Liang Y, Ham JD, Rizwan R, Chen J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 2020;59:102975.

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