熱點應用：揭秘蛋白質的熱穩定性！
#本文由馬爾文帕納科醫藥業務發展經理 韓佩韋博士供稿#
蛋白質的熱穩定性研究對于加深對蛋白質的結構和功能的了解有著非常重要的意義。差示掃描量熱技術（DSC）是直接測量熱轉變過程焓變（ΔH）唯一的分析方法，例如蛋白質，核酸或其他生物多聚物的熱變性過程，為表征蛋白質及其他生物分子的熱穩定性建立“金標準”技術。
一、焓變對于蛋白質的穩定性意味著什么？
1，什么是焓（hán）變（ΔH）？
ΔH（焓變）是在恒壓狀態下將系統升高至溫度T過程中攝取的總能量。對于蛋白質而言，這意味著用于使蛋白質發生去折疊所花費的能量（熱量），此過程中 ΔH 是為正值，代表這是一個吸熱過程。這種能量與蛋白質中所有原子和分子運動相關，以及維系蛋白質保持折疊構象中的鍵能。
通過將吸熱譜圖下方的面積進行積分（見圖 1）可以計算得到焓變（ΔH）。焓變用每摩爾蛋白質的吸收的卡路里（或焦耳）來表示。由于蛋白質在 DSC 實驗中暴露于升高的溫度，因此蛋白質開始發生熱變性，并伴隨著非共價鍵的斷裂。焓變（ΔH）與維系蛋白質天然（折疊）構象中所需的價鍵數量有關。焓變（ΔH）也取決于我們測量總蛋白質濃度的準確程度。如果蛋白質濃度不是很準確, 則會影響到計算出的ΔH值。
2，焓變（ΔH）值可以在實踐中告訴我們什么？
當您比較不同蛋白質的DSC結果時，具有較大ΔH值的蛋白質不一定比具有較小ΔH的蛋白質更穩定。由于ΔH值會對蛋白質摩爾濃度歸一化，因此該值通常與蛋白質的尺寸成比例。大多數蛋白質具有相同的鍵密度（單位體積內的價鍵數量），因此，期待具有較大分子量的蛋白質也具有較大的焓變（ΔH）值也是合理的。
3，焓變（ΔH）的決定因素是什么？
焓變（ΔH）取決于溶液中天然蛋白質的百分比。
一個非常重要的考慮是DSC僅測量初始處于折疊（天然）構象中的蛋白質的ΔH值。ΔH值取決于具有折疊（活性）構象的濃度。如果初始折疊蛋白質組分小于總蛋白質濃度（即活性濃度小于100％），則計算出的ΔH值將相應地變小。
下圖顯示了在儲存期間的不同時間測量的相同蛋白質的DSC圖譜。藍色曲線圖譜表示新鮮制備的蛋白質，是100％天然（折疊）蛋白質。當蛋白質樣品在儲存期間發生部分變性時，溶液中的天然蛋白質的比例開始下降，導致DSC圖譜的焓變降低。當我們擁有100％天然蛋白質的參考DSC圖譜時，我們可以根據不同狀態樣品的相對ΔH值來估計每個樣品中的折疊蛋白質比例。
4，如何判斷蛋白質是否失活？
到目前為止，我們已提及的焓變是指通過DSC儀器直接測量到的“熱”焓，也就是熱力學焓變，通常表示為ΔHcal，這是其他任何非量熱技術，例如圓二色譜（CD），表面等離子共振（SPR）等技術不能獲取的焓變量。
還有另一種其他技術可以獲取的焓變類型，即范霍夫焓變 - ΔHVH，我們同樣可以通過DSC數據計算得出。范霍夫焓變（ΔHVH）可從通過DSC非兩狀態模型（non-2-state model）擬合得到。
兩種不同的焓變對蛋白質熱穩定性的測定又有什么實際意義呢？
在DSC技術中，ΔHcal僅由DSC熱轉變峰曲線積分的面積來確定，而ΔHVH僅通過熱轉變峰曲線的形狀來確定。轉變峰形越尖銳，ΔHVH越大，反之亦然。ΔHcal是具有濃度依賴性的，但ΔHVH不是。
若ΔHcal/ΔHVH比例為1，通常意味著所研究的熱轉變狀態符合兩狀態去折疊（Two-state unfolding model）模型。如果ΔHcal/ΔHVH比例大于1，則意味著存在顯著密集的中間體存在; 而ΔHcal/ΔHVH比小于1，則意味著存在分子間相互作用。
使用ΔHcal/ΔHVH可以幫我們估測是否有很大部分蛋白質是失活的。如果我們有一個簡單的單結構域蛋白質，并且假定沒有中間體，則我們可以預測，其去折疊過程的ΔHcal/ΔHVH的比值不會遠離1。因此，如果ΔHcal顯著低于ΔHVH，可以表明很大部分蛋白質已經失活。
綜上所述，對DSC中ΔH數據的分析可以讓我們了解蛋白質的去折疊機制，以及多少蛋白質處于其活性的天然構象。
二、TM值如何與和蛋白質穩定性相關？
中點轉變溫度TM
我們可以從DSC數據中提取多個熱力學參數，例如ΔH，ΔHVH（范霍夫焓變），ΔCP和ΔG，但最廣泛使用的參數是TM。順便提一下，這也是最容易和最準確的值 - TM是最大峰值所對應的溫度。
“蛋白質穩定性”有多種定義。最常見的是，對于工業上有重要意義的蛋白質，該術語是指在生理溫度下的功能（或操作）穩定性; 即，他們可以在37°C下發揮多長時間的生物功能？這可以通過需要花幾天或數周時間的等溫研究來評估，或者，如果使用差示掃描量熱法（DSC），則可以在幾分鐘內變性蛋白質。
通過DSC獲得的哪個熱力學參數與功能穩定性相關度最佳？事實證明，是TM值。
熱力學穩定性（ΔG）是功能穩定性的較差的預測因子; 技術上，ΔG僅適用于可逆去折疊過程，此外，它由TM，ΔH和ΔCP計算得到，后者可能很難獲取。
一個例子是TM和ΔG與人肉桿菌蛋白抗原血清型C的半數聚集時間(half time)（作為功能穩定性的量度）的相關性，用作模型蛋白。ΔG與T1 / 2 agg. 相關系數（R）僅為0.4，而TM 與 T1 / 2 agg.的相關系數是0.92。（來自J Pharm Sci的數據，2011 Mar; 100（3）：836-48）
思考TM的一種方式：
如下圖所示，假設我們用 DSC 掃描兩種不同配方中的蛋白質或兩種不同的蛋白質構建體，則 TM 值向低溫方向 5℃ 的負偏移（穩定性下降）實際上反映了在 37℃ 條件下的 Fu （蛋白去折疊比例）由2％增加到 3％。溫度 T 下的 Fu 蛋白可以通過圖像化的方式估算，即溫度 T 以下的曲線下陰影區域面積和整個曲線下方面積的百分比。
由于聚集體的生成可能是濃度依賴的過程，因此較高濃度的去折疊蛋白質（紅色掃描曲線）將導致較快的聚合（更大組分的去折疊狀態（U）才能轉換為不可逆變性狀態（I）。參見下面的原理圖。
這種解析的一個推論是，曲線的整體形狀應該是相似的。我們假定這種情況是對于在不同配方中的相同蛋白質或由一個母分子衍生出來的具有相似構建體的蛋白質。但是，對于完全不同的蛋白質，使用TM值作為用于穩定性比較的預測指標則應該謹慎使用。
擴展閱讀（www.malvernpanalytical.com）
Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theory andpractice
Differential Scanning Calorimetry (DSC) forBiopharmaceutical Development: Versatility and Power
The Power of Heat: Digging Deeper with DifferentialScanning Calorimetry to Study Key Protein Characteristics
PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀：DSC
差式掃描量熱法（DSC）是一種直接分析天然蛋白質或其他生物分子熱穩定性的技術，無需外在熒光素或者內源熒光，它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發生熱變性過程中的熱容變化來實現。
馬爾文帕納科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀能夠幫助用戶快速確認維持高級結構穩定性的最佳條件，提供簡介、無縫的工作流程和自動化批量數據分析，其所提供的熱穩定性信息被業內視為“金標準”技術，是一種非標記、全局性的數據。
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馬爾文帕納科的使命是通過對材料進行化學、物性和結構分析，打造出更勝一籌的客戶導向型創新解決方案和服務，從而提高效率和產生可觀的經濟效益。通過利用包括人工智能和預測分析在內的最近技術發展，我們能夠逐步實現這一目標。這將讓各個行業和組織的科學家和工程師可解決一系列難題，如最大程度地提高生產率、開發更高質量的產品，并縮短產品上市時間。
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蛋白質的熱穩定性研究對于加深對蛋白質的結構和功能的了解有著非常重要的意義。差示掃描量熱技術（DSC）是直接測量熱轉變過程焓變（ΔH）唯一的分析方法，例如蛋白質，核酸或其他生物多聚物的熱變性過程，為表征蛋白質及其他生物分子的熱穩定性建立“金標準”技術。
一、焓變對于蛋白質的穩定性意味著什么？
1，什么是焓（hán）變（ΔH）？
ΔH（焓變）是在恒壓狀態下將系統升高至溫度T過程中攝取的總能量。對于蛋白質而言，這意味著用于使蛋白質發生去折疊所花費的能量（熱量），此過程中 ΔH 是為正值，代表這是一個吸熱過程。這種能量與蛋白質中所有原子和分子運動相關，以及維系蛋白質保持折疊構象中的鍵能。
通過將吸熱譜圖下方的面積進行積分（見圖 1）可以計算得到焓變（ΔH）。焓變用每摩爾蛋白質的吸收的卡路里（或焦耳）來表示。由于蛋白質在 DSC 實驗中暴露于升高的溫度，因此蛋白質開始發生熱變性，并伴隨著非共價鍵的斷裂。焓變（ΔH）與維系蛋白質天然（折疊）構象中所需的價鍵數量有關。焓變（ΔH）也取決于我們測量總蛋白質濃度的準確程度。如果蛋白質濃度不是很準確, 則會影響到計算出的ΔH值。
2，焓變（ΔH）值可以在實踐中告訴我們什么？
當您比較不同蛋白質的DSC結果時，具有較大ΔH值的蛋白質不一定比具有較小ΔH的蛋白質更穩定。由于ΔH值會對蛋白質摩爾濃度歸一化，因此該值通常與蛋白質的尺寸成比例。大多數蛋白質具有相同的鍵密度（單位體積內的價鍵數量），因此，期待具有較大分子量的蛋白質也具有較大的焓變（ΔH）值也是合理的。
3，焓變（ΔH）的決定因素是什么？
焓變（ΔH）取決于溶液中天然蛋白質的百分比。
一個非常重要的考慮是DSC僅測量初始處于折疊（天然）構象中的蛋白質的ΔH值。ΔH值取決于具有折疊（活性）構象的濃度。如果初始折疊蛋白質組分小于總蛋白質濃度（即活性濃度小于100％），則計算出的ΔH值將相應地變小。
下圖顯示了在儲存期間的不同時間測量的相同蛋白質的DSC圖譜。藍色曲線圖譜表示新鮮制備的蛋白質，是100％天然（折疊）蛋白質。當蛋白質樣品在儲存期間發生部分變性時，溶液中的天然蛋白質的比例開始下降，導致DSC圖譜的焓變降低。當我們擁有100％天然蛋白質的參考DSC圖譜時，我們可以根據不同狀態樣品的相對ΔH值來估計每個樣品中的折疊蛋白質比例。
4，如何判斷蛋白質是否失活？
到目前為止，我們已提及的焓變是指通過DSC儀器直接測量到的“熱”焓，也就是熱力學焓變，通常表示為ΔHcal，這是其他任何非量熱技術，例如圓二色譜（CD），表面等離子共振（SPR）等技術不能獲取的焓變量。
還有另一種其他技術可以獲取的焓變類型，即范霍夫焓變 - ΔHVH，我們同樣可以通過DSC數據計算得出。范霍夫焓變（ΔHVH）可從通過DSC非兩狀態模型（non-2-state model）擬合得到。
兩種不同的焓變對蛋白質熱穩定性的測定又有什么實際意義呢？
在DSC技術中，ΔHcal僅由DSC熱轉變峰曲線積分的面積來確定，而ΔHVH僅通過熱轉變峰曲線的形狀來確定。轉變峰形越尖銳，ΔHVH越大，反之亦然。ΔHcal是具有濃度依賴性的，但ΔHVH不是。
若ΔHcal/ΔHVH比例為1，通常意味著所研究的熱轉變狀態符合兩狀態去折疊（Two-state unfolding model）模型。如果ΔHcal/ΔHVH比例大于1，則意味著存在顯著密集的中間體存在; 而ΔHcal/ΔHVH比小于1，則意味著存在分子間相互作用。
使用ΔHcal/ΔHVH可以幫我們估測是否有很大部分蛋白質是失活的。如果我們有一個簡單的單結構域蛋白質，并且假定沒有中間體，則我們可以預測，其去折疊過程的ΔHcal/ΔHVH的比值不會遠離1。因此，如果ΔHcal顯著低于ΔHVH，可以表明很大部分蛋白質已經失活。
綜上所述，對DSC中ΔH數據的分析可以讓我們了解蛋白質的去折疊機制，以及多少蛋白質處于其活性的天然構象。
二、TM值如何與和蛋白質穩定性相關？
中點轉變溫度TM
我們可以從DSC數據中提取多個熱力學參數，例如ΔH，ΔHVH（范霍夫焓變），ΔCP和ΔG，但最廣泛使用的參數是TM。順便提一下，這也是最容易和最準確的值 - TM是最大峰值所對應的溫度。
“蛋白質穩定性”有多種定義。最常見的是，對于工業上有重要意義的蛋白質，該術語是指在生理溫度下的功能（或操作）穩定性; 即，他們可以在37°C下發揮多長時間的生物功能？這可以通過需要花幾天或數周時間的等溫研究來評估，或者，如果使用差示掃描量熱法（DSC），則可以在幾分鐘內變性蛋白質。
通過DSC獲得的哪個熱力學參數與功能穩定性相關度最佳？事實證明，是TM值。
熱力學穩定性（ΔG）是功能穩定性的較差的預測因子; 技術上，ΔG僅適用于可逆去折疊過程，此外，它由TM，ΔH和ΔCP計算得到，后者可能很難獲取。
一個例子是TM和ΔG與人肉桿菌蛋白抗原血清型C的半數聚集時間(half time)（作為功能穩定性的量度）的相關性，用作模型蛋白。ΔG與T1 / 2 agg. 相關系數（R）僅為0.4，而TM 與 T1 / 2 agg.的相關系數是0.92。（來自J Pharm Sci的數據，2011 Mar; 100（3）：836-48）
思考TM的一種方式：
如下圖所示，假設我們用 DSC 掃描兩種不同配方中的蛋白質或兩種不同的蛋白質構建體，則 TM 值向低溫方向 5℃ 的負偏移（穩定性下降）實際上反映了在 37℃ 條件下的 Fu （蛋白去折疊比例）由2％增加到 3％。溫度 T 下的 Fu 蛋白可以通過圖像化的方式估算，即溫度 T 以下的曲線下陰影區域面積和整個曲線下方面積的百分比。
由于聚集體的生成可能是濃度依賴的過程，因此較高濃度的去折疊蛋白質（紅色掃描曲線）將導致較快的聚合（更大組分的去折疊狀態（U）才能轉換為不可逆變性狀態（I）。參見下面的原理圖。
這種解析的一個推論是，曲線的整體形狀應該是相似的。我們假定這種情況是對于在不同配方中的相同蛋白質或由一個母分子衍生出來的具有相似構建體的蛋白質。但是，對于完全不同的蛋白質，使用TM值作為用于穩定性比較的預測指標則應該謹慎使用。
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Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theory andpractice
Differential Scanning Calorimetry (DSC) forBiopharmaceutical Development: Versatility and Power
The Power of Heat: Digging Deeper with DifferentialScanning Calorimetry to Study Key Protein Characteristics
PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀：DSC
差式掃描量熱法（DSC）是一種直接分析天然蛋白質或其他生物分子熱穩定性的技術，無需外在熒光素或者內源熒光，它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發生熱變性過程中的熱容變化來實現。
馬爾文帕納科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀能夠幫助用戶快速確認維持高級結構穩定性的最佳條件，提供簡介、無縫的工作流程和自動化批量數據分析，其所提供的熱穩定性信息被業內視為“金標準”技術，是一種非標記、全局性的數據。
關于馬爾文帕納科
馬爾文帕納科的使命是通過對材料進行化學、物性和結構分析，打造出更勝一籌的客戶導向型創新解決方案和服務，從而提高效率和產生可觀的經濟效益。通過利用包括人工智能和預測分析在內的最近技術發展，我們能夠逐步實現這一目標。這將讓各個行業和組織的科學家和工程師可解決一系列難題，如最大程度地提高生產率、開發更高質量的產品，并縮短產品上市時間。
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