實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）實驗流程

    一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉錄)
　　
　　不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-TimePCR對RNA樣品的質量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
　　
　　在總rna的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂;取2ug進行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時，要用DNaseI進行消化(因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑)。
　　
　　二、DNAseI消化樣品RNA中的DNA
　　
　　用DNaseI消化DNA
　　
　　組份加量
　　
　　模板(RNA)10ug
　　
　　RNaseInhibitor4ul
　　
　　DNaseIbuffer10ul
　　
　　DNaseI10ul
　　
　　DEPC處理H2O至100ul
　　
　　混勻，37℃90min
　　
　　三、RNA瓊脂糖凝膠電泳
　　
　　1.1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：
　　
　　1)稱取瓊脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS緩沖液和39.5ml的DEPC水，放微波爐里溶化。
　　
　　2)待冷卻到60攝氏度左右時，加入1ml甲醛，搖勻(避免產生氣泡)。倒入凝膠板上凝固30min。
　　
　　2.取各個RNA樣品4µl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2µl混勻，加入變性膠加樣孔中。
　　
　　3.120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。
　　
　　4.RNA電泳結果如下圖所示。可見28S和18S兩條明亮條帶，無DNA條帶污染。
　　
　　實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）實驗流程
　　
　　四.RNA反轉錄為cDNA
　　
　　反轉錄程序(以MBI的M-MLV為例)
　　
　　組份加量(20ul體系)加量(40ul體系)
　　
　　模板(RNA)0.1~2.5ug(根據條帶的亮度適當調整)3ug(根據條帶的亮度適當調整)
　　
　　引物T18(50uM)(或其他引物)2.0ul4.0ul
　　
　　DEPC處理H2O至12.5ul至25ul
　　
　　混勻，70℃5min，立即冰浴
　　
　　5*buffer4.0ul8.0ul
　　
　　dNTP(10mM)2.0ul4.0ul
　　
　　RNaseInhibitor0.5ul1.0ul
　　
　　混勻，37℃5min
　　
　　M-MLV1.0ul2.0ul
　　
　　42℃60min，70℃10min
　　
　　反轉錄引物的選擇與Real-TimePCR引物設計的要求
　　
　　1)隨機六聚體引物：
　　
　　當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA*鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
　　
　　2)Oligo(dT)：
　　
　　是一種僅對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。特別適合檢測多個基因的表達，這樣可以節約反轉錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達、從極少量細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平。
　　
　　3)特異性引物：
　　
　　zui特異的反轉錄方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，*條鏈的合成可由與mRNA3’端zui靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。
　　
　　做RealTimePCR時，用于SYBRGreenI/EvaGreen法時的一對引物與一般PCR的引物，在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求：
　　
　　①Tm=55-65℃
　　
　　②GC=30-80%
　　
　　③PCR擴增產物長度：引物的產物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。
　　
　　④引物的退火溫度要高，一般要在60℃以上。
　　
　　要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，zui好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
　　
　　至于設計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都應該可以的。做染料法zui關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不易。
　　
　　五、cDNA與引物質量檢測
　　
　　取0.2ml薄壁PCR管，編號。向各管中加入含染料2×PCRTaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物濃度10uM)，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管補加水至20ul。
　　
　　組份加量
　　
　　2×PCRTaqMix10ul
　　
　　10uMPrimerFW0.5ul
　　
　　10uMPrimerRV0.5ul
　　
　　TemplateDNA1ul
　　
　　ddH2O混勻至20ul
　　
　　混勻，置于TP600PCR儀中。95℃5min;95℃15s，60℃35s，40cycles;72℃5min;4℃pause。
　　
　　取擴增產物各8μl，DL2000分子量標準5μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察。
　　
　　選擇特異性好，擴增效率高的引物作為實時熒光使用引物。
　　
　　六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況：
　　
　　由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。
　　
　　七、定量PCR檢測：
　　
　　取0.2ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，對應的cDNA各1ul。一管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25ul。
　　
　　組份加量
　　
　　模板(cDNA)/ddH2O1.0ul
　　
　　10uM引物F/R0.5ul
　　
　　2×qPCRMix12.5ul
　　
　　ddH2O11.0ul
　　
　　混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預變性后，95℃15s→65℃35s(熒光檢測)，40cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴增設成一個溫度，只在擴增出現問題時才會考慮設梯度。
　　
　　八、擴增曲線和溶解曲線
　　
　　實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）實驗流程
　　
　　實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）實驗流程
　　
　　溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增。
　　
　　一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期，其形狀是一條平滑的S型曲線。
　　
　　如果在熒光背景信號階段出現很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態雜質;
　　
　　如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
　　
　　如果引物二聚體存在則陰性對照會出現抬頭現象，這在Real-TimePCR中很難避免;
　　
　　若是陰性對照的溶解曲線出現和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結果不可用。
　　
　　在溶解曲線中出現雙峰有三種可能：
　　
　　①引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設計引物;
　　
　　②在做基因表達差異時容易出現DNA被擴增峰(只在引物跨內含子時存在)，出現原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA;
　　
　　③擴增非特異，這時要重新摸擴增條件或重新設計并驗證引物。
　　
　　九、表達差異的計算方法
　　
　　絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數;相對定量方法則是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本或是目標轉錄本在不同時相的表達差異之間的表達差異。
　　
　　2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。
　　
　　在有些情況下，并不需要對轉錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經過某種處理后表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀。
　　
　　2-△△CT方法的推導(詳見實時定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達量)
　　
　　補充：在DNaseI消化樣品RNA中的DNA后，需要對樣品重新進行氯仿抽提，具體實驗流程如下：
　　
　　消化后總體積10Oul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200ulDEPC水。
　　
　　1.向離心管中加入等體積氯仿(約300ul)，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現白色片狀沉淀。4℃14000rpm離心8min，取上清(約250ul)。
　　
　　2.加入1/10體積的NaAC(3M)(約25ul)和預冷的等體積異丙醇(約280ul)，-20℃放置20min。
　　
　　3.4℃14000rpm離心15min，去上清，注意不要觸到沉淀。
　　
　　4.加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm離心3min，去上清。
　　
　　5.瞬時離心，用200ul(或10ul)的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(勿吸到管底的沉淀)。
　　
　　6.把離心管放置于超凈臺晾至約5-10分鐘(勿完全干燥，否則很難溶)。加入30~50μl的無RNase的水，靜止1min后，振蕩30sec，瞬時離心。
　　
　　7.將提取的RNA立即進行下游實驗，或放-20℃保存。