circRNA研究揭示矽肺炎癥和肺纖維化的干預靶點

    東南大學醫學院巢杰教授課題組主要研究方向為肺炎和肺纖維化的機理機制的研究。該課題組利用Arraystar CircRNA芯片研究發現circRNA circHECTD1通過HECTD1/ZC3H12A依賴的泛素化介導SiO₂誘導的矽肺中巨噬細胞活化，釋放相關炎性因子和纖維化因子，繼而影響矽肺纖維化的進程，結果表明circHECTD1/ ZC3H12A/HECTD1可能是矽肺炎癥和纖維化的有效干預靶點。該研究成果發表在課題組在國際知名學術期刊Theranostics（影響因子8.766）。（芯片實驗由康成提供技術服務） 

研究背景： 
    矽肺是由于長期吸入游離二氧化硅（SiO₂）粉塵所引起的以肺組織持續慢性炎癥、進行性肺纖維化為主，并伴有全身系統性炎癥為特征的全身性疾病。矽肺一旦發生，肺損傷呈進行性發展，即使停止粉塵暴露，肺部病變依然進展，導致肺功能障礙，呼吸衰竭，甚至死亡。由于對矽肺的發病機制知之甚少，因此發現矽肺早期診斷分子標志物以及干預肺纖維化進程的靶標已成為迫切需要解決的問題。 
    CircRNA是一類具有閉合環狀結構的非編碼RNA，在發育、細胞功能和特定的病理學應答中比如癌癥生物學中起到非常重要的作用。circRNA可以作為microRNA海綿競爭性結合miRNA，從而來調控基因表達。研究circRNA和它們參與疾病發生發展的機理機制以及為臨床診斷及治療提供靶點已經變得越來越重要。 

研究思路： 
    本研究著重于研究SiO₂吸入引起肺部細胞激活，釋放的細胞因子和化學趨化因子，參與炎癥反應和肺纖維化的過程及其機制，為了研究circRNA在這一過程及機制中的作用，研究者運用Arraystar Mouse circRNA芯片研究SiO₂誘導的小鼠矽肺模型的肺組織和生理鹽水處理的正常小鼠的肺組織的circRNA差異表達譜，篩選出120個差異表達的circRNA（其中73個circRNA上調，47個circRNA下調），結合實驗室前期研究，差異表達的circHECTD1的宿主基因HECTD1可以通過泛素化參與SiO₂誘導的矽肺的炎癥反應和肺纖維化， 因此將circ HECTD1作為重點研究。 
    qRT-PCR研究發現，circHECTD1在SiO₂誘導的肺巨噬細胞中表達顯著下調。circHECTD1慢病毒轉染巨噬細胞系后研究細胞活力和遷移率，發現轉染后，circHECTD1可以減弱SiO₂誘導的巨噬細胞活化及遷移率上升，因此推斷circHECTD1可以介導SiO₂誘導的巨噬細胞的活化。隨后通過RIP研究發現轉錄因子ZC3H12A可以和circHECTD1相互作用介導這一活化的過程。通過WB及qRT-PCR研究發現circHECTD1的宿主基因HECTD1的mRNA水平和蛋白水平在SiO₂誘導的肺巨噬細胞中明顯上調，同時circHECTD1慢病毒轉染巨噬細胞系中，HECTD1 mRNA水平不受影響，但是蛋白表達明顯被抑制，HECTD1 CRISPR激活質粒ACT和酶切抑制質粒NIC表明，HECTD1可以影響SiO₂誘導的巨噬細胞的表型變化和細胞活力，同時通過免疫沉淀研究發現，ZC3H12A也可以和HECTD1相互作用參與這一過程。作者通過研究ACT和NIC巨噬細胞上清液加到成纖維細胞，測定其遷移率和細胞活力，發現SiO₂誘導后，HECTD1表達上調，同時影響成纖維細胞活化及遷移。以上研究表明circHECTD1經ZC3H12A介導的泛素化，影響下游HECTD1的表達，參與肺泡巨噬細胞極性轉化，釋放相關炎性因子和至纖維化因子，最終加速纖維化過程。最后作者測定了HECTD1在臨床矽肺患者的支氣管肺泡灌洗液中巨噬細胞中表達量，發現其明顯上調，且與巨噬細胞標志物F4/80共定位，推斷HECTD1可能是矽肺炎癥和纖維化的有效干預靶點。 

技術路線：

結果展示：

 
圖1：circRNA芯片篩選小鼠肺組織中差異表達circRNA進行聚類、火山圖和散點圖分析

 
圖2：circHECTD1在SiO2誘導的肺巨噬細胞中表達下調， 可以和ZC3H12A互作介導SiO2誘導的
肺巨噬細胞活化

 
圖3：HECTD1在SiO2誘導的肺巨噬細胞中表達上調，circHECTD1可以通過
HECTD1/ZC3H12A泛素化介導SiO2誘導的肺巨噬細胞的活化，促進肺纖維化

 
圖4：circHECTD1宿主基因HECTD1在矽肺患者中高表達，可能是矽肺炎癥和纖維化的
有效干預靶點

研究意義 
    本研究運用Arraystar CircRNA 芯片研究circRNA在SiO2誘導的矽肺炎癥反應和肺纖維化過程中的機理機制。研究發現circHECTD1可以和ZC3H12A相互作用介導SiO2誘導的巨噬細胞的活化，研究還發現circHECTD1的宿主基因HECTD1可以影響SiO2誘導的巨噬細胞的活化及成纖維細胞活化和遷移，同時ZC3H12A也可以和HECTD1相互作用參與這一過程。以上研究表明circHECTD1經ZC3H12A介導的泛素化，影響下游HECTD1的表達，參與肺巨噬細胞極性轉化，釋放相關炎性因子和纖維化因子，加速纖維化過程。臨床驗證發現HECTD1在臨床矽肺患者的支氣管肺泡灌洗液中巨噬細胞中表達明顯上調，且與巨噬細胞標志物F4/80共定位，表明HECTD1可以為矽肺炎癥和纖維化的臨床診斷及治療提供靶點。 

作者簡介 
    巢杰：東南大學醫學院，教授、博士生導師，Nature出版集團旗下期刊Scientific Reports編委會成員，2015年度江蘇省“六大人才高峰”高層次人才，美國毒理學會（Society of Toxicology，SOT）和美國生理學會（American Physiological Society，APS）會員。主要研究方向是肺部炎癥及肺纖維化機制的基礎研究和臨床研究，以通訊作者在Cell Death Dis、Front Behav NeurosciS、Cell Physiol Biochem、Theranostics等發表SCI論文數百余篇，SCI他引數千余次。 

原文出處 
    circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1/ZC3H12A-Dependent Ubiquitination. Theranostics. 2018.