Nature子刊：揭示lncRNA在EMT過程中發揮的作用
西班牙塞利維亞大學教授José A Pintor-Toro長期從事生物化學與細胞生物學研究， 近期，其實驗室利用Arraystar LncRNA芯片研究發現了在TGF-β誘導的上皮-間質細胞轉化（EMT）過程早期起直接調控作用的lncRNA分子—lnc-Spry1，TGF-β誘導直接引起lnc-Spry1下調，從而引發EMT過程影響細胞侵襲遷移。lnc-Spry1也可與U2AF65作用，影響可變剪切，從而在轉錄和轉錄后層面調控基因表達。該研究成果發表在細胞凋亡領域權威期刊Cell Death & Differentiation（IF: 8.218）（芯片實驗由Arraystar提供技術服務）
研究背景
上皮-間質細胞轉化（EMT）過程是一個基本的細胞表型轉變過程。期間上皮細胞失去胞間緊密連接和與基底膜的附著極性，轉化為間質細胞，獲得侵襲和遷移活性。在轉錄層面上，TGF-β可以直接激活EMT過程，導致下游通路和一系列基因表達的改變。除此之外， pre-mRNA的可變剪接和lncRNA的調控作用也在轉錄后層面上增加了調控層面的復雜性。LncRNA作為重要的調控型RNA分子，可以在多個層面影響EMT過程。目前已有的文章只研究了TGF-β信號下游和影響細胞穩定性的lncRNA，本文章的研究目的在于找到EMT早期起直接調控作用的lncRNA分子。
上皮-間質細胞轉化（EMT）過程是一個基本的細胞表型轉變過程。期間上皮細胞失去胞間緊密連接和與基底膜的附著極性，轉化為間質細胞，獲得侵襲和遷移活性。在轉錄層面上，TGF-β可以直接激活EMT過程，導致下游通路和一系列基因表達的改變。除此之外， pre-mRNA的可變剪接和lncRNA的調控作用也在轉錄后層面上增加了調控層面的復雜性。LncRNA作為重要的調控型RNA分子，可以在多個層面影響EMT過程。目前已有的文章只研究了TGF-β信號下游和影響細胞穩定性的lncRNA，本文章的研究目的在于找到EMT早期起直接調控作用的lncRNA分子。
研究思路
為了探究EMT過程中直接影響早期調控的lncRNA分子，本次研究應用美國Arraystar mouse LncRNA芯片篩選TGF-β誘導NMuMG細胞系2h后差異表達的lncRNA和mRNA。其中435個lncRNA和1090個mRNA發生了顯著差異變化。之后選擇了表達下調的Spry1臨近lncRNA—lnc-Spry1進行研究，qPCR驗證表達趨勢與芯片相符。
對該lncRNA進行功能研究發現，該分子在TGF-β誘導后15min就開始下調，說明是一個早期的調控分子，敲除Smad4后lnc-Spry1發生顯著變化，因此該lncRNA分子是TGF-β-Smad依賴通路的靶標基因。將該分子進行shRNA敲除實驗，發現間質細胞特征marker vimentin和Snail1升高，上皮細胞特征marker E-cadherin降低，產生遷移和侵襲表型變化，說明lnc-Spry1可以重塑細胞骨架，影響細胞遷移和侵襲。
通過研究lnc-Spry1和臨近基因Spry1的表達，發現兩者具有表達相關性，敲除lnc-Spry1后進行高通量檢測和GO分析，發現趨化因子和細胞因子相關基因發生顯著變化。進一步進行lnc-Spry1的機制研究，通過RIP和RNA pull down技術，發現lnc-Spry1可以結合可變剪切相關蛋白U2AF65，從而影響EMT轉化相關基因FGFR pre-mRNA的可變剪切過程。
為了探究EMT過程中直接影響早期調控的lncRNA分子，本次研究應用美國Arraystar mouse LncRNA芯片篩選TGF-β誘導NMuMG細胞系2h后差異表達的lncRNA和mRNA。其中435個lncRNA和1090個mRNA發生了顯著差異變化。之后選擇了表達下調的Spry1臨近lncRNA—lnc-Spry1進行研究，qPCR驗證表達趨勢與芯片相符。
對該lncRNA進行功能研究發現，該分子在TGF-β誘導后15min就開始下調，說明是一個早期的調控分子，敲除Smad4后lnc-Spry1發生顯著變化，因此該lncRNA分子是TGF-β-Smad依賴通路的靶標基因。將該分子進行shRNA敲除實驗，發現間質細胞特征marker vimentin和Snail1升高，上皮細胞特征marker E-cadherin降低，產生遷移和侵襲表型變化，說明lnc-Spry1可以重塑細胞骨架，影響細胞遷移和侵襲。
通過研究lnc-Spry1和臨近基因Spry1的表達，發現兩者具有表達相關性，敲除lnc-Spry1后進行高通量檢測和GO分析，發現趨化因子和細胞因子相關基因發生顯著變化。進一步進行lnc-Spry1的機制研究，通過RIP和RNA pull down技術，發現lnc-Spry1可以結合可變剪切相關蛋白U2AF65，從而影響EMT轉化相關基因FGFR pre-mRNA的可變剪切過程。
技術路線
結果展示
圖一、A：TGF-β處理后芯片檢測中顯著變化的EMT相關基因；B：TGF-β處理后芯片檢測差異變化顯著的lncRNA分布散點圖；C：TGF-β處理后芯片檢測FC>2，P<0.05的lncRNA分布火山圖；
圖二、g. Lnc-spry1敲除后影響基因表達的聚類圖；h. Lnc-spry1敲除后進行GO分析，發現富集的GO條目與趨化因子、細胞因子相關。
圖三、a. RNA pull down聯合質譜實驗 Lnc-spry1可結合U2AF65；b. RIP實驗 U2AF65可以結合Lnc-spry1。
研究意義
該研究揭示了lnc-Spry1和TGF-β誘導的EMT早期調控之間的關系。TGF-β誘導NMuMG細胞直接引起lnc-Spry1下調，通過TGFβ-Smad通路重塑細胞骨架，影響細胞遷移侵襲。lnc-Spry1可與U2AF65結合，影響EMT轉化相關基因FGFR pre-mRNA的可變剪切。從而在轉錄和轉錄后層面調控基因表達。
該研究揭示了lnc-Spry1和TGF-β誘導的EMT早期調控之間的關系。TGF-β誘導NMuMG細胞直接引起lnc-Spry1下調，通過TGFβ-Smad通路重塑細胞骨架，影響細胞遷移侵襲。lnc-Spry1可與U2AF65結合，影響EMT轉化相關基因FGFR pre-mRNA的可變剪切。從而在轉錄和轉錄后層面調控基因表達。
作者介紹
José A Pintor-Toro，博士。西班牙塞利維亞大學生物分子與再生醫學中心信號轉導分部教授。長期從事植物、生物化學與細胞生物學研究，科研成果先后在Nature Genetics，PNAS，Nucleic Acids Research, Cell Death & Differentiation 等國際權威學術刊物上發表。
José A Pintor-Toro，博士。西班牙塞利維亞大學生物分子與再生醫學中心信號轉導分部教授。長期從事植物、生物化學與細胞生物學研究，科研成果先后在Nature Genetics，PNAS，Nucleic Acids Research, Cell Death & Differentiation 等國際權威學術刊物上發表。
原文出處
Downregulation of Lnc-Spry1 mediates TGF-β-induced epithelial–mesenchymal transition by transcriptional and posttranscriptional regulatory mechanisms. Cell Death and Differentiation. 2017.
Downregulation of Lnc-Spry1 mediates TGF-β-induced epithelial–mesenchymal transition by transcriptional and posttranscriptional regulatory mechanisms. Cell Death and Differentiation. 2017.
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