血清替代品：XerumFree XF205培養基添加物使用說明書
血清替代品：XerumFreeTM XF205 培養基添加物使用說明書
以下翻譯僅供參考！最終使用者請參看英文原文說明書。
使細胞能在無血清環境中生長
確保無動物成分且經過GMP認證的細胞培養添加物
細胞的無血清培養具有一定的挑戰性。這篇文章的目的是指導終端使用者平穩過渡到無血清環境中，且避免所有不足的或不恰當的努力。
理想的過渡到無血清環境下應該經歷幾個階段，逐漸地篩選使細胞生長在無血清環境下。然而，如果所有關鍵步驟都能很好的解決，直接過渡到無血清環境下也有可能會成功。
無論使用什么方法，關鍵點包括細胞接種的生長狀態，細胞接種密度，繼代培養技術和細胞培養體系的生物物理屬性。
TNCbio’s XerumFreeTM血清替代品已經作為一種培養基添加物使用，使用方法跟傳統的細胞培養血清一樣。然而濃度是5倍濃縮液，因此你可以添加2%濃縮液到常規培養基中，操作步驟跟平常一樣。
內容
使用前重點注意事項
1 制備
1.1 常規的細胞培養基的制備
1.2 過渡到無血清環境下的常規調整方法
1.2.1 直接過渡
1.2.2 后續調整
2 XF205的使用
2.1 細胞系
2.1.1 貼壁依賴型細胞系
2.1.2 貼壁非依賴型細胞系
2.2 干細胞
2.2.1 準備步驟—包被
2.2.2 hESCs和hiPSCs的培養
2.2.3 MSCs的培養
2.3 原代細胞培養
2.3.1 普通建議
2.3.2 細胞培養的具體建議
2.3.3 推薦的體系
使用濃縮的XerumFreeTM XF205之前的重點注意事項：
--XF205是一種替代血清的細胞培養基附加物，并不是最終的培養基。
--XF205必須和基礎細胞培養基一起使用（比如IMDM, DMEM-F12或其它基礎培養基）。
--無需對XerumFreeTM XF205或加了XerumFreeTM后的培養基過濾處理。
--如果需要，先濾滅培養基，然后在無菌條件下添加XerumFreeTM XF205到濾滅的培養基中。
--相比于血清， XF205是5倍濃縮液，因此使用同等的量的話（比如2% XF205替代10% FBS）。
--XF205不含有生長因子如細胞因子，激素等，因此也不含有胰島素。
1 制備
1.1 無血清細胞培養基的普通制備方法
使用之前輕輕地、短暫地搖晃XerumFreeTM瓶。
添加5倍濃縮的XerumFreeTM到你的基礎培養基中（如10% FBS相當于2% XF205）。
不要濾滅XerumFreeTM或不要濾滅添加完XerumFreeTM后的培養基（XF 205是無菌的）。
如果培養基需要濾滅，則需在添加XF之前濾滅。
在這個階段不要添加抗生素，實際上，抗生素像其它許多化合物一樣會結合到血清的漿蛋白上，尤其是結合到白蛋白片段上。因此在無血清和白蛋白條件下同樣濃度的抗生素將顯示出較高的生物活性，且這種增加的活性對細胞生長可能產生有害的影響。
以防無抗生素培養不可行，建議添加50mg/L的慶大霉素到培養基中。
*一些使用者喜歡或需要在無胰島素條件下培養細胞，如果您使用XerumFreeTM培養細胞，您可以選擇添加或不添加胰島素或其它的生長因子來培養細胞。如果需要添加胰島素促進細胞增殖或性能研究，我們建議添加終濃度為1.25mg/L重組胰島素到細胞培養基中。
1.2 過渡到無血清環境中的常規方法
通常有兩種方法使細胞過渡到無血清環境下生長。
1.2.1 直接過渡
直接把細胞從含有血清的培養基轉換到無血清培養基中。
1.2.2 逐漸適應法
按照以下步驟逐步地把細胞從含有血清的培養基中過渡到無血清培養基中，每一步把含有血清的培養基減半，因此按照下面的比例值來添加無血清培養基：
階段1：50% XerumFree-supplemented 培養基 / 50% Serum-supplemented 培養基
階段2：75% XerumFree-supplemented 培養基 / 25% Serum-supplemented 培養基
階段3：87.5% XerumFree-supplemented 培養基 / 12.5% Serum-supplemented 培養基
階段4：93.75% XerumFree-supplemented 培養基 / 6.25% Serum-supplemented 培養基
階段5：96.88% XerumFree-supplemented 培養基 / 3.12% Serum-supplemented 培養基
階段6：98.44% XerumFree-supplemented 培養基 / 1.56% Serum-supplemented 培養基
階段7：100% XerumFree-supplemented 培養基
按照以上步驟如果細胞生長不好，則返回一步，細胞生長恢復正常再繼續下面的階段。
細胞培養物可能由不同的細胞系構成（貼壁細胞或懸浮細胞）或原代細胞培養物。然而，從功能角度來看，干細胞制備過程中細胞類型可能分化為不同的程度或顯示出未分化特性。在不同情況下，為了保證我們培養的細胞獲得最大的成功，我們要考慮到不同的細胞類型有不同的要求，需要不同的過渡方法。
基于此原因我們把過渡程序分為三部分，對應于三種細胞分別為：
2.1 –細胞系
2.2 –干細胞
2.3 –原代細胞
2.1 細胞系
以下操作流程對于常規（二倍體細胞，有限細胞系）或轉化的或永生細胞系（無限細胞系）是有效的。
2.1.1 貼壁依賴性細胞系
關鍵成功因素：
--理想的細胞貼壁包被物
--最小化胰蛋白酶作用
--抗生素體系的選擇
實驗步驟
A） 用足夠的細胞貼壁因子包被細胞培養容器表面。
--一些商用的包被試劑如PronectinTM F, MapTRIXTM或同等的其它產品
--纖連蛋白或多聚賴氨酸或其它
--少量FBS(如對于T25燒瓶添加500ul) 37℃孵育過夜，隨后用新鮮培養基或PBS洗兩遍。
--利于細胞貼壁的一種即用型塑料器皿。
B）解離細胞成單層細胞
--在無血清條件下使用標準胰蛋白酶可能不太可行，因為血清中含有胰蛋白酶抑制劑。因此為了避免對細胞產生不可逆的損傷，在無血清條件下，最小化殘留胰蛋白酶水解活性是非常重要的。為達到最佳效果，可使用胰蛋白酶抑制劑（比如來源于大豆）或用無哺乳動物源的分散劑如Accutase™，且Accutase™在傳代過程無需進行失活處理或去除。另外也可以通過洗細胞的方法來去除大部分殘留的胰蛋白酶。然而這個方法需要額外的離心步驟，而離心對于某些細胞類型可能有損傷。
--優先選擇：不使用胰蛋白酶，使用Accutase™ 或 Detachin™分散細胞為單層細胞；這些細胞分散液已經能夠滿足溫和，有效的分散貼壁細胞的要求；將不會損傷細胞膜和表面表位并且能夠保持蛋白表面的結構和功能性能完整。
C）細胞以20000/cm2的密度接種到按照Point 1所制備的完全培養基中。
在從血清培養基到無血清培養基適應過程的第一步中觀察高接種密度的狀態是重要的。細胞一般可分泌大量調控細胞貼壁、生長和增殖的因子到培養基中。然而，在剛接種時新鮮的無血清培養基中是不含這些因子的，因此為了及時誘導產生足夠的自分泌/旁分泌因子，接種時達到細胞密度的臨界值是至關重要的。
D）孵育并維持細胞在37℃中培養直至達到80-90%的匯合。
在這個階段每2-3天換75%培養基。不要丟棄用過的培養基，而把它們收集起來，濾滅并保存于4℃為下一步使用。如果細胞在任何點看起來是停止狀態的，那么給更多的時間讓細胞去適應新的無血清環境。
E）當接近匯合率時，以1：2或1：3的比例分開細胞。
對于XerumFreeTM的第二個階段，包被是不需要的，強烈建議使用上一步用過的培養基，因為里面含有調控細胞貼壁，蔓延，生長和增殖的自分泌因子。在含有75%的新鮮無血清培養基+25%用過的培養基（上一步收集起來的）接種細胞。繼續每2-3天用75%新鮮培養基更換，以供給細胞，且按照d）步驟繼續收集用過的培養基。
F) 重復E）步驟，與之前在含有血清的培養基中的生長情況相比，直到細胞顯示出類似生長動態。這個時候可以認為細胞系完全適應了無血清條件培養，這可能需要4-6個階段。
G) 從這個階段開始，培養基中可能需要加抗生素。我們建議用廣譜性抗生素慶大霉素；與標準的青霉素/鏈霉素溶液相比，慶大霉素有較低的毒性，慶大霉素建議的使用濃度是：50mg/L。
H）一旦細胞適應無血清培養，就應使用原始的分配比例（在含有血清的培養條件下）。
2.1 細胞系
2.1.2 貼壁非依賴性細胞系
以下操作流程適用于生長在懸浮液中的細胞系。對于貼壁細胞過渡到無血清環境中懸浮生長，請參照TNC BIO’s 技術說明“細胞從單層到無血清環境懸浮培養的適應過程”。
關鍵成功因素：
抗生素體系的選擇
實驗步驟
A） 當細胞密度達到3-5×106細胞/ml（依賴于細胞系），開始轉換到XerumFreeTM添加的培養基中。收集細胞懸浮液，取出少量進行細胞計數并對整個懸浮液以200g的離心力離心5分鐘。
B） 完成細胞計數
C） 在添加XerumFreeTM的培養基中細胞密度為106細胞/ml時，重懸細胞顆粒。
在過渡過程的第一個步驟觀察高的細胞接種密度是非常重要的。然而，在接種步驟中，新鮮的無血清培養基中是不含這些因子的，因此為了及時誘導產生足夠的自分泌/旁分泌因子，接種時達到細胞密度的臨界值是至關重要的。
D） 在37℃中孵育細胞培養物直到細胞密度達到大約3-5×106細胞/ml。
E）通過添加適當體積的新鮮培養基，以1：3或1：4的比例分開懸浮培養物（比如25ml細胞懸浮液+75ml 含有XerumFreeTM的培養基，分到四個單獨的培養瓶中）
F）重復E）步驟直到培養物顯示出像在原來含有血清的培養基中的生長動態。從那時起，細胞系已經完全適應并可按照含有血清的培養基中的原始比例。
G）從這個階段開始，培養基中開始加入抗生素。
我們建議使用濃度為50mg/L慶大霉素，與標準的青霉素/鏈霉素溶液相比，慶大霉素有較低的毒性。
2.2 干細胞
2.2.1 準備步驟—培養器皿表面的包被
如果培養的是人多能干細胞（hPSCs）或多潛能間充質/基質細胞，那么用足夠的包被劑處理培養器皿表面是至關重要的，我們一般使用的是制備較粗糙的胞外基質，比如MatrigelTM。
然而，這些包被劑里含有一些不明確的成分比如小鼠腫瘤源的物質和動物源的成分存在等。
如果需要使用包被劑，我們推薦使用StemAdhreTM，因其是一個明確的基質，只含有一個由純粹的人的序列組成的重組蛋白，因此可視為無動物成分（ACF），然而，并不是所有的組織培養板都能用StemAdhreTM Defined Matrix來包被。
第三種來自Corning 的feeder free，xeno free且化學成分明確的包被劑 SynthemaxTM Surface，這個產品為模仿細胞的天然環境而設計，經過特殊處理、即用型包被塑料器皿，經驗證一些hESC和hiPSC細胞系已取得很好的結果。在初始的過渡期轉換到SynthemaxTM可能需要注意，但幾個階段后細胞又會恢復良好的生長狀態。
在血清替代品的使用說明中不包括MatrigelTM和StemAdhreTM的包被操作步驟。
關于SynthemaxTM包被塑料器皿的的詳細信息請登錄：
http://www.corning.com/lifesciences/us_canada/en/technical_resources/surfaces/cell_culture/synthemax.aspx
重點注意事項：
--XerumFreeTM不含任何的生長因子，因此也不含有bFGF和胰島素。培養干細胞時我們建議添加bFGF或胰島素或IGF。
--XerumFreeTM不含硒，培養干細胞時我們建議用含有硒的培養基。
2.2.2 hESCs 和hiPSCs的無飼養層培養
按照上面的包被步驟在含有2-3%的XerumFreeTM的DEME/F-12培養基里培養多能干細胞。
外部的和自分泌的信號的作用是基質重塑和維持胚胎干細胞的更新（Przybyla, L.M. and Voldman J. PNAS vol. 109 no. 3, 835-840, 2012）。基于此，為了不耗盡這些重要因子，按照下面的描述改變操作步驟使其粘附在培養基中極其重要。
hESCs和hiPSCs完全培養基的制備
--使用常規基礎培養基（比如DMEM-F12）
--添加濃度為2 mM的L-谷氨酰胺到培養基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到終體積為100ml的培養基中）
--添加bFGF使終濃度為4 ng/ml（比如母液為10 ug/ml吸取40ul到終體積為100ml的培養基中）
--添加2-巰基乙醇使終濃度為0.1mM（比如母液為55mM吸取182ul到100ml培養基中）
--如果使用抗生素保護體系，我們建議使用濃度為50mg/ml的慶大霉素。
--因為XerumFreeTM不含胰島素，你可以添加（重組）胰島素或IGF到培養基中
--如果必要可以濾滅培養基
--添加2% 的XerumFreeTM XF205
含有XerumFreeTM的培養基中培養hESCs—第一階段
--用MatrigelTM或StemAdhreTM包被6孔培養板或用SynthemaxTM培養器皿。
--融化一瓶新鮮的hESC或從現有的培養基中轉移hESC細胞（從飼養層或無飼養層培養體系），用膠原酶或其它更好的方法處理，像平常一樣使用Accutas和sediment，Accutas是非動物源的且具有蛋白酶和膠原酶活性，在hESC細胞的培養中已顯示出顯著的效果。
--用MatrigelTM或StemAdhreTM包被培養板：吸取過量的Matrigel或StemAdhre包被試劑
--SynthemaxTM培養板：無需處理，即可使用
--置細胞于按照以上步驟制備的完全培養基中
--通過連續7天每天更換75%的培養基培養細胞，余留25%的含有細胞的自分泌因子的培養基是非常重要的。
注意：與MEFs相比，細胞在MatrigelTM包被的板子上生長的更好且密度更高，且不失其形態學特征
細胞培養的傳代
--用DPBS洗細胞一次
--添加分散酶（比如在DMEM-F12培養基中每孔添加1ml濃度為2mg/ml的酶溶液）并在37℃中孵育
--通過輕輕地拍打培養板的一側在10-15 min內分散細胞
注意：勿刮細胞
--把含有細胞的分散后的溶液轉移到一個滅菌的15ml管中，為了收集盡可能多的細胞，再用每孔1ml的生長培養基沖洗培養孔。
--離心并洗兩次
--用吸頭輕輕地吹打細胞，這樣可使細胞在分散酶中輕易地分散開。
注意：體積較小的細胞和單個細胞不能很好地存活。
--以正常的比例包被培養板（Matrigel, StemAdhere, Synthemax-請參看上面的說明）
2.2.3 MSCs的培養
下面操作規程是在明確地環境中培養MSCs，可以是從液氮中保存的冰凍的細胞系或在不同的細胞培養體系中生長的培養物。
一般考慮
--如果MSCs細胞沒有及時接種應保存在液氮中，過高的溫度（-80℃）將對細胞造成不可逆的損傷。
--使用無菌操作技術且在超凈工作臺里操作
--37℃，5% CO2孵育箱內濕潤孵育細胞
--培養器皿必須按照在使用說明B部分的準備步驟關于“培養表面的包被”的說明來處理
--細胞接種密度以2000 /cm2，避免生長的細胞融合，當細胞密度達到大約70%時繼代一次
--使用無需經血清失活的消化酶，比如AccutaseTM
--收集之后，輕輕地吸吐細胞使其重懸，不要旋渦細胞
--按照下面的描述準備細胞培養過程中所用到的所有材料和設備
--預熱所有與細胞接觸的溶液和培養基
完全培養基的制備
--你可以用你常規使用的基礎培養基
--添加濃度為2 mM的L-谷氨酰胺到培養基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到終體積為100ml的培養基中）
--添加bFGF使終濃度為4 ng/ml（比如母液為10 pg/ml吸取40pl到終體積為100ml的培養基中）
--如果使用抗生素保護體系，我們建議使用濃度為50mg/L的慶大霉素。
--因為XerumFreeTM不含胰島素，你可以添加（重組）胰島素或IGF到培養基中
--如果必要可以濾滅培養基
--添加2% 的XerumFreeTM XF205
解凍細胞
在解凍過程中，必須要小心地輕輕地處理細胞，且立即放入預熱的完全培養基中。
--在15ml的錐形離心管里放入10ml預熱的完全培養基
--把細胞從液氮中轉移出來
--把盛有細胞的錐形瓶放入37℃水浴中并輕輕地攪拌直至所有的冰融化。
--立即用70%乙醇消毒錐形瓶
--立即把細胞轉入含有預熱培養基的錐形瓶以300×g離心5min
--吸取上清液并小心地在完全培養基中重懸細胞
--以2000-4000個細胞/cm2的細胞密度接種在由MatrigelTM或StemAdhereTM包被的細胞培養皿中，或即用型SynthemaxTM培養皿（Greiner）
--在37℃，5% CO2的濕潤孵育器中孵育細胞
--每天通過更換75%培養基來培養細胞，余留25%含有細胞自分泌因子的培養基是非常重要的。
當達到大約70%的融合時繼代細胞培養
細胞的繼代
--吸取細胞培養基，用DPBS(無Ca++/Mg++)洗細胞一次。
--用足夠體積的AccutaseTM溶液浸沒細胞層并在37℃孵育5min。如必要可通過輕輕地拍打細胞培養器皿的側面分散細胞。
--加入完全培養基稀釋細胞消化溶液（至少加兩倍體積的AccutaseTM）
--轉移細胞懸浮液到離心管中，然后以300×g離心5min
--棄上清然后在完全培養基中通過輕輕地吸吐重懸細胞
--細胞計數
--以2000個細胞/cm2的密度接種細胞懸浮液到一個新的包被的培養板中或即用型SynthemaxTM培養皿中（參看上面“培養器皿表面的包被”）
--在37℃，5% CO2的濕潤孵育器中孵育細胞
--當細胞融合達到近70%時盡快地進行繼代培養，一般情況下每周繼代兩次。
2.3 原代培養
原代細胞培養物存在于剛剛從活的組織或器官分離而來的生長的細胞。這些細胞代表著細胞培養世界的核心：到目前為止所有的細胞系都起始于原代培養。除了產生新的細胞系，原代培養代表著一個非常重要的工具，尤其在藥物發現和生產，再生醫學和基礎研究領域里。
從技術角度來看，在細胞培養過程中原代細胞培養仍然是最微妙的一部分。新分離的細胞沒有任何選擇壓力且高度保留著體內部分的特征。這就要滿足新分離細胞對營養和生理的要求。在理想地情況下，對于原代細胞的培養應盡可能地模仿體內的環境，比如細胞外空間。只在明確的細胞培養條件下，且對營養和細胞因子的供給完全地控制才能夠實現這一理想情況。
原代細胞培養有著非常不同的要求，取決于組織的來源。在無不明確的添加物比如牛血清或其衍生物的條件下，已經證明XerumFreeTM在不同的原代細胞培養中取得成功。然而，沒有一個通用的能滿足所有原代細胞類型培養的配方。
下面的指導方針分為兩部分：應用于所有細胞類型的常規建議和主要組織類型的具體要求。
2.3.1 常規建議
無論所用的是哪種細胞類型，如果選擇無血清條件下進行原代細胞培養，需按照以下幾點進行處理。
無血清貼壁因子
準備步驟--培養器皿表面的包被
在明確的培養條件下，用足夠的包被劑處理培養表面是至關重要的。通常細胞外基質（ECM）的制備較粗糙，比如小鼠肉瘤提取物（比如基質膠）或提取的膠原。然而，不明確的天然成分和動物源成分的存在顯示許多應用是有問題的。
如果不想培養基中含有的動物源成分造成任何問題，快速的解決方法可以考慮用已采用少量FBS過夜處理的細胞培養板。這個方法是方便經濟有效的，然而它將意味著從完全明確的培養環境的概念中后退一步。
今天可以用現成的重組的，明確的包被試劑盒，盡管是來源于纖連蛋白，層粘連蛋白，膠原蛋白，E-鈣粘蛋白，玻連蛋白等生物合成的信號肽，但能模仿ECM蛋白的貼壁性質。
無血清酶抑制劑
消化酶
開始一個原代培養主要有兩種方法：通過從組織塊中分離或酶解離而來的產物。在后一種方法中起始組織用蛋白水解酶或酶溶液消化，比如分散酶，膠原酶和胰蛋白酶。
接種細胞之前必須小心地中和/失活任何有蛋白水解活性的成分。尤其是使用胰酶時必須解決這個問題。
無血清的環境中使用標準胰酶制備可能會出現問題，因為血清中含有胰蛋白酶抑制劑。分散細胞之后，在無血清條件下胰酶活性必須被失活，可以用一個高效的胰酶抑制劑，比如大豆胰酶抑制劑。
作為胰酶的替代品，強烈建議使用AccutaseTM，因為其不需要被失活。這個重組的非哺乳動物來源的酶已經高效地應用于一系列原代細胞培養中，包括原代平滑肌細胞，原代人內皮細胞，原代雞神經細胞。
無血清蛋白的結合
抗生素的使用
像其它化合物一樣抗生素結合到血清的血漿蛋白上，尤其是白蛋白片段。因此，在無血清和白蛋白的條件下同樣的抗生素濃度將顯示出較高的生物活性，且增加的活性將對細胞生長造成有害影響。尤其是鏈霉素會干擾哺乳動物細胞蛋白合成水平。
如果無抗生素培養是不可行的，我們建議使用濃度為50mg/L的慶大霉素。
2.3.2. 針對細胞類型的具體建議
根據組織來源不同，原代細胞培養有不同的細胞培養要求。
在這個冊子里我們沒有具體描述原代細胞培養操作流程，因為不同的細胞類型之間是截然不同的。一般情況下我們建議用傳統的方法分離原代細胞，并且用5倍濃縮的XerumFreeTM代替血清。
這將滿足大多數細胞類型的營養需求，事實上，在哺乳動物細胞培養這個領域，營養需求稍有不同，更多地依賴于細胞類型，比如肝細胞需要更高的營養濃度。
不同類型的細胞之間對生長因子和激素的需求是不同的。
下面的表格列出了我們推薦用XerumFreeTM代替動物血清的細胞培養基制備。
關于指定的四種細胞類型，生長因子和激素的添加對于細胞發育和增殖是理想的。
2.3.3推薦的四種主要的原代細胞類型的細胞培養基的建立
| 原代細胞培養類型 |
推薦 |
終濃度 |
要求 |
|
|
生長因子 |
激素 |
|||
| 原代腎細胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
重組人胰島素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | |
| 皮質醇 | 0.1 ug/ml | 必需的 | ||
| 腎上腺素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 50 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 三碘-L-甲腺原氨酸 | 10 pg/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 10 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 原代肝細胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2-3% |
重組人胰島素 | 5 ug/ml | 必需的 | |
| 皮質醇 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 50 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 原代角質細胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
牛垂體提取物（BPE） | 4 ul/ml | 必需的 | |
| 皮質醇 | 5 ug/ml | 必需的 | ||
| 腎上腺素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 0.125 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 原代心肌細胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
T3（三碘-L-甲腺原氨酸） | 1ng/ml（1.5nM） | 必需的 | |
| 重組人胰島素 | 5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 5 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 重組人bEGF | 5 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 神經元細胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
重組人EGF | 50 ng/ml | 理想的/有益的 | |
| 重組人胰島素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
*為了使細胞很好地貼壁和蔓延，我們強烈建議用CaCl2(0.06 mM)
Nb. 不要濾滅XerumFreeTM。我們建議制備含有谷氨酰胺的基礎培養基，如果生長因子和激素需要濾滅，可以濾滅之后再添加XerumFreeTM。
Nb. XerumFreeTM是5倍濃縮的，因此所加的5倍濃縮液比通常所用的FBS體積低（比如10% FBS相當于2% XerumFreeTM）。
Nb. 對于其它的原代培養細胞類型，可以聯系TNC Bio，關于建議生長因子和激素的添加量，我們將盡可能地提供最大支持。
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