Northern blot實驗方法
實驗方法
- Northern blot技術
- Northern Blot
| 實驗方法原理 | Northern blot的基本概述是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉移至尼龍膜等固相膜載體上，用放射性或非放射性標記DNA或RNA特異性探針對固定于固相膜上的mRNA進行雜交，洗膜去除非特異性結合雜交信號，經放射自顯影或現色反應，對雜交信號進行分析。將雜交的mRNA分子在電泳中遷移位置與標準分子量分子進行比較，即可知道細胞中特定的基因轉錄產物的大小；對雜交信號的強弱比較，可以知曉該基因表達mRNA水平的強弱。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
DNA |
| 試劑、試劑盒 |
MOPS電泳buffer 甲醛凝膠加樣buffer EB EGFR探針 DIG SSC |
| 儀器、耗材 |
水平電泳儀 制冰機 恒溫水浴箱 凝膠成像系統 EP管 移液器 Tip頭 |
| 實驗步驟 |
一、RNA轉移與固定
1. 變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min。 2. 按southern blot實驗中DNA轉移方法及裝置轉移總RNA至尼龍膜上（過程中注意無RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時。
4. RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min。
5. 于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%亞甲藍溶液中浸泡5~10 min。 6. 去離子水淋洗膜5~10 min，可見RNA標準及28s及18 sRNA的條帶，軟鉛筆標記。 二、預雜交、雜交及顯色
1. Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。
5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
6. 將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數min至1天（出現顏色時不要搖動）。
7. 當出現條帶時，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現色。 8. 照相記錄，80℃烤干，儲存。
9. 掃描計算EGFR基因擴增的倍數。 |
| 注意事項 |
1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。
2. 凝膠中最好不要加入EB，以免降低雜交的效率。 3. 為降低膜雜交本底，可適當延長預雜交時間。 |
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