LaVision雙光子顯微鏡-腫瘤生長與入侵動態成像

Stephanie Alexander · Gudrun E. Koehl ·Markus Hirschberg · Edward K. Geissler · Peter Friedl

Accepted: 13 October 2008 / Published online: 6 November 2008

 

摘要：從首次感染部位向鄰近基質的轉移入侵是腫瘤發展過程中的關鍵步驟，研究成果較少。腫瘤入侵的原理以各種體外模型給出了實驗性的表述；但是，體內的關鍵性步驟和機制仍然不清楚。這里，我們通過落射熒光成像和多光子顯微鏡建立了一個修正的皮膚折疊室模型來闡述關于HT-1080纖維肉瘤細胞的原位移植，生長和入侵。這種策略允許對作為獨立細胞或者集體粘絲或者細胞團沿著富含膠原的細胞外基質和增補宿主組織包括紋狀肌肉絲和淋巴管的腫瘤生長、腫瘤誘導血管形成和入侵進行重復成像。這個修正的窗口模型將適用于闡述腫瘤轉移和入侵的機制，以及相關的實驗性治療。

 

    HT-1080雙色纖維肉瘤細胞表達細胞質DsRed2和核組蛋白2B（H2B）-EGFP –EGFP (Yamamoto et al. 2004)培養在改良的鷹培養基(PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Germany)中，補充10%的胎牛血清(Aurion, Wageningen, The Netherlands)，盤尼西林和鏈霉素（都100ug/ml;PAN)和潮霉素B（0.2mg/ml；Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)在37%濕潤的5%CO2的培養環境中。

 

    對于多光子顯微鏡，小鼠被用異氟烷麻醉并被穩定固定在37℃的溫控平臺上。使用一個落射多光子顯微鏡，如(Friedl et al. 2007; Wolf et al. 2003)所描述，并配備了OPO裝置(OPO; APE, Berlin, Germany)用于1100nm波段的雙光子激發，以及紅外修正的20X/0.95N.A(Olympus)物鏡。如果沒有特定聲明，EGFP，DsRed2和SHG的獲取都是使用的832nm的激發光。由帶通濾波器確定的檢測光波段為400/40(藍），535/50（綠），605/70（紅），和710/75（紅外）。以5um的步長對深達250um的成像深度進行順序3D堆棧。通過向尾靜脈注射4mg熒光葡聚糖對血管顯影。在注射了淋巴歸巢環肽LyP-1（100ug）之后活化的淋巴管被檢測到。(Laakkonen et al. 2002)

 

    圖像被使用ImageJ 1.40 g (W. Rasband, NIH), ImSpector 3.4 (LaVision Bio- Tec GmbH), and Photoshop CS 8.0.1 (Adobe Systems Inc.)重構和分析。以寬的平方X長Xπ/6計算腫瘤體積。有絲分裂和細胞凋亡的比例通過H2B-EGFP模式從每區域30到100個細胞中確定。

 

Fig.1 在背側皮膚褶皺室中HT-1080纖維肉瘤細胞的滴落和注射方法比較.6（c）、7（d）天后通過明場和落射熒光顯微鏡觀察的細胞應用，生長位置（a，b）和宏觀腫瘤形態。在建立的模型中，允許細胞懸浮液或者細胞球粘附到外科手術準備好的真皮組織表面上，獲得了在真皮層與蓋玻片（a.c）間的3D腫瘤生長。使用細針將細胞球注射進真皮中阻止蓋玻片和真皮內產量增加間的反應（b,d)。標尺1mm（概圖）和250um（細節）

Fig 2. 腫瘤生長階段。 a 由落射熒光顯微鏡監測的移植瘤生長和入侵的時間進程。新生血管的插入，不存在（3天）和存在（7天）。標尺1mm。b 通過以day 1的體積進行歸一化的腫瘤體積。mean+-SD（n=9）。c HT-1080移植腫瘤在6天的時候的腫瘤形態，血管化，分生和凋亡。使用多光子顯微鏡以激發波長1100nm（左）和832nm（右）獲取的一個中央中流區域的3D重構。核形態包括了有絲分裂（白色箭頭）和凋亡圖（黑色箭頭）。標尺50um。插圖顯示了前相（P）、中相（M）和后相（LA）以及凋亡圖（A）。d 對時間依賴的分生和凋亡定量化。數據顯示3個非依賴性腫瘤的10-25個獨立區域的Mean±SEM

Fig 3. 近紅外多光子顯微鏡顯示環繞HT-1080雙色腫瘤的腫瘤誘導產生血管及其結構。Z軸為一個6天大腫瘤的從腫瘤邊緣（-50um）到腫瘤內部區域（-80um）（紅色細胞質；黃色細胞核）。通過FITC-葡聚糖注射現實的密布血管（綠），先前存在的線形血管（綠色箭頭）和不規則形狀的新生血管（藍色箭頭）。膠原纖維（黑色箭頭）和肌肉絲（白色箭頭），通過二次諧波檢測（灰度）。標尺50um

Fig 4. HT-1080雙色細胞的原位入侵模型。a 注射后6天入侵類型的分類。缺少入侵（上，左）并且散布單個細胞（上，右；白色箭頭），散射的或者緊密地絲狀整體入侵（下圖）。標尺250um。 b 45個連續的非依賴性腫瘤的按中所分入侵模式的頻率。11天時，沿著紋狀肌肉纖維集體入侵絲的定位。標尺100um。d 單一細胞侵入脂肪組織隨后進行分散的，部分整體的入侵。對照-少量圓的脂肪細胞（星號）被HT-1080細胞包圍。1100nm的激發光來檢測遍布的血管(Alexa Fluor 660-dextran,紅色),，腫瘤細胞質（綠色假彩），SHG（灰度）；832nm用于腫瘤細胞核（白色）。標尺100um

Fig 5. HT-1080細胞沿淋巴管的入侵。a 由多光子顯微鏡對邊緣而非腫瘤中心的活化淋巴管產生的單幅圖片。用FITC連接的LyP-1縮氨酸來檢測。深度已標明在圖上（um）。b 3D堆棧投影表明淋巴管內（白色箭頭）和外淋巴管入侵（黑色箭頭）。標尺100um