Western Blot過程中常見的問題及可能原因分析

瀏覽次數(shù)：4874　發(fā)布日期：2011-3-10　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

Western Blot過程中常見的問題及可能原因分析

問題	可能原因	驗(yàn)證或解決辦法
背景高	膜沒有完全均勻濕透	使用100% 甲醇浸透膜5-10min
	洗膜不充分	增加洗液體積和洗滌次數(shù)
	阻斷不充分	增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）
	二抗?jié)舛冗^高	降低二抗?jié)舛?/DIV>
	檢測過程中膜干燥	保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象
	曝光過度	縮短曝光時(shí)間
	抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)	檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng)
沒有陽性條帶，或者陽性條帶比較弱	抗體染色不充分	增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間
	酶失活	直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物
	標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低	設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。
	試劑不匹配	一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級檢測系統(tǒng)的有效性
	一抗失效	選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液
	HRP抑制劑	所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉
	膜沒有完全均勻濕透	使用100%甲醇浸透膜
	靶蛋白分子量小于10Kd	選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間
	甲醇濃度過高	過高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
	轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠	對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時(shí)間
	抗體染色不充分	增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間
	標(biāo)本中靶蛋白含量太低	增加標(biāo)本上樣量。
	HRP抑制劑	所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉
	抗體活性降低	選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置
	封閉過度	減少封閉劑的量或縮短時(shí)間；換用不同封閉劑類型
	曝光時(shí)間過短	延長曝光時(shí)間
條帶位置不對；或有非特異性條帶色帶）	二抗的非特異性結(jié)合	增加一個(gè)對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對重鏈的）
	一抗的特異性不夠	使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性
	蛋白降解	使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑
	二聚體或多聚體存在	增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度
	抗體濃度過高	降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶
	蛋白上樣量過大	降低上樣量
	封閉劑中有聚集體	使用前過濾封閉試劑
	HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體	過濾二抗試劑，去除聚集體
	HRP含量過高	降低酶聯(lián)二抗的濃度

發(fā)布者：巴傲得生物科技有限公司上海分公司
聯(lián)系電話：021-50327163
E-mail：yonghong1028@126.com

【點(diǎn)擊可查看巴傲得生物科技有限公司上海分公司相關(guān)產(chǎn)品】

標(biāo)簽： Western Blot 常見問題

分享到：QQ空間新浪微博騰訊微博微信

【所有文章】【本類新聞】【相關(guān)產(chǎn)品】【關(guān)閉窗口】

本類文章

本類新聞

^{<blockquote id="1rljh"></blockquote>}

^{<blockquote id="1rljh"></blockquote>}