FITC標(biāo)記抗體-Marsshall氏法

 

材料：

抗體球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液、無(wú)菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25—50ml）、冰及冰槽（或1000ml燒杯）、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻璃棒、棉線及燒杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等；

 

方法與步驟：

1.       抗體的準(zhǔn)備。量取適量已知濃度的球蛋白溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最終球蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌速度適當(dāng)，即以不起泡沫為宜攪拌5—10min；

2.       熒光素的準(zhǔn)備。根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素的比例，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末；

3.       結(jié)合（或稱標(biāo)記）。將稱取的熒光色素緩慢加入到球蛋白溶液中，并不停地?cái)嚢瑁�避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻璃棒上，在大約5—10min內(nèi)加完。然后繼續(xù)攪拌12—18h。因熒光素與球蛋白結(jié)合期間要求必須保持蛋白溶液于4℃左右，所以需要即使地添冰或去水。亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中；

4.       透析。熒光素與球蛋白結(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液以2500r/min離心20min，除去其中少量的沉淀物后，裝入透析袋中再置于燒杯中，在0—4℃下用pH8.0的緩沖鹽溶液透析過(guò)夜；

5.       過(guò)柱。取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，過(guò)葡萄糖凝膠G-25或G-50柱，分離出游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定；