利用ProteOn XPR36分析蛋白與小分子相互作用
很多小分子化合物具有特殊的活性基團，可以結合某些特定的蛋白或核酸，激發或者抑制生物大分子的活性，從而影響生命的過程。人體內種類繁多的維生素類、輔酶等物質就是這些活性小分子化合物。在藥物方面，有很多藥都是一些有著特殊活性的小分子化合物，分子量從200 Dalton到數千Dalton。因此，小分子藥物篩選、優化和藥物機理研究成為了制藥和藥理學研究的重點。目前關于這方面研究的手段，從不同的目的出發有不同的方法。但如果要測定某些化合物和靶蛋白之間的相互作用動力學和親和力，最好的辦法非SPR技術莫屬。
ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統是Bio-Rad公司2007年隆重推出的新一代SPR生物傳感器。它具有6×6的芯片格式，可以在芯片上同時或分次固定6種蛋白（ligand），然后化合物（analyte）以6種不同的濃度平行地流過所有ligand，36對相互作用的反應曲線同時記錄，同時分析。只需一次進樣就可以分析一種藥物和多種不同靶蛋白之間相互作用的動力學和親和力常數。這種分析方法不僅大大提高了分析速度，而且由于分析的時候多個濃度、多個不同的ligand和analyte是在完全相同條件下反應的，得到的結果最準確，重復性也最好。
ProteOn XPR36系統分析小分子化合物采用靈敏度最高的GLH芯片。這種芯片的基質較長，羧基位點較多，因此能結合較多的ligand蛋白，而且蛋白活性保持較好。這樣的芯片能夠產生較高的反應信號，非常適合分析小分子化合物。以下是使用該款芯片分析蛋白和小分子化合物相互作用的幾個例子：
CAII蛋白和小分子抑制劑的相互作用：
首先將CAII蛋白標記在GLH芯片上。采用氨基偶聯，將CAII蛋白用pH 5.0的NaAc溶解，標記在芯片上，可達21,200 RU。待基線穩定后再上小分子抑制劑溶液。待反應全部結束后，用ProteOn Manager軟件分析結果。這些小分子抑制劑的名稱、分子量、反應最高濃度和結果等信息見下表，反應曲線見下圖：
|
名稱 |
MW |
反應最高濃度（mM） |
ka (1/Ms) |
kd (1/s) |
KD (M) |
Rmax (RU) |
|
Sulpiride |
341 |
250 |
2.52×103 |
0.26 |
1.0×10-4 |
188 |
|
Sulfanilamide |
172 |
50 |
2.40×104 |
0.12 |
4.8×10-6 |
112 |
|
Furosemide |
331 |
50 |
5.15×104 |
0.04 |
7.1×10-7 |
180 |
|
CBS |
201 |
50 |
2.83×104 |
0.03 |
1.2×10-6 |
105 |
|
Dansylamide |
250 |
10 |
1.33×105 |
0.09 |
6.5×10-7 |
105 |
|
1,3-benzene- disulfonamide |
236 |
10 |
1.11×105 |
0.09 |
8.1×10-7 |
99 |
|
Benzenesulfonamide |
157 |
50 |
1.17×105 |
0.12 |
1.0×10-6 |
114 |
|
7-fuoro-2,1,3-benzoxadiazole- 4-sulfonamide |
217 |
2 |
4.64×105 |
0.01 |
2.8×10-8 |
82 |
|
Acetazolamide |
222 |
2 |
9.28×105 |
0.02 |
2.6×10-8 |
99 |
|
Methylsulfonamide |
95 |
2,500 |
- |
- |
3.2×10-4 |
22 |
以上實驗用的小分子化合物分子量非常小，因而信號比大分子蛋白要低很多。GLH芯片通過增大標記量，有效地提高了反應的信號，而且得到的結果與前人用傳統的芯片分析得到的結果均相符。同時需要指出，所有這些反應，都是在一兩天的時間內完成的，大大縮短了分析時間。
Anti-DNP抗體和DNP標記氨基酸的相互作用分析：
如果作為ligand的蛋白分子非常大（超過100kD），那么這些分子在標記的時候用于空間位阻的關系，會占據基質的多個結合位點，導致標記效率下降。為此，很多人用ligand和analyte分子量之比來衡量芯片或儀器的靈敏度。GLH芯片可以達到400倍的檢測靈敏度，也就是說，即使ligand分子比analyte分子的分子量高400倍，也依然可以檢測到相互作用。為此，我們設計了一個小分子抗體（約150 KD）和幾個抗原之間的相互作用實驗。每個實驗的具體信息和反應曲線見下表和下圖：
|
名稱 |
MW |
ka (1/Ms) |
kd (1/s) |
KD (M) |
Rmax (RU) |
|
DNP-glycine |
241 |
1.99×106 |
0.095 |
4.77×10-9 |
36 |
|
DNP-valine |
283 |
1.24×106 |
0.098 |
7.90×10-8 |
41 |
|
DNP-tryptophan |
370 |
7.14×105 |
0.251 |
3.52×10-7 |
75 |
上面的例子都是檢測分子量僅有二、三百的小分子化合物，而抗體分子量很大。實驗中抗體標記了18550RU，因此可以檢測到分子量相差如此之大的analyte。
CAII蛋白的標記活性測定
在小分子化合物檢測中，作為ligand的蛋白活性對于檢測的靈敏度影響非常大。很多人在做SPR實驗的時候往往都會忽視這個問題，因為許多實驗都不像SPR對蛋白活性如此敏感。在上面兩個實驗中，如果蛋白活性喪失超過1/2，很難想象還如何檢測到這么小分子量的化合物。可問題在于，氨基偶聯幾乎不可避免地會造成蛋白活性的降低，主要原因可能是部分蛋白的活性位點被芯片上的基質所覆蓋。為此，我們又設計了一個實驗，就是根據許多化合物和CAII相互作用的Rmax值，推算GLH芯片上有活力的蛋白信號，最后和標記時直觀看到的標記信號做一個比較，就可以計算出蛋白標記后的活力占總蛋白的比例。
這個實驗的方法是，把CAII蛋白標記在GLH芯片和一種傳統基質的芯片上，分別測定一系列化合物反應的Rmax值，然后根據兩個分子的分子量和結合比，推算出蛋白的活性。每一個實驗測得的蛋白活性都不完全一樣，對這些數據進行線性回歸，可以得到活性的平均值。見下圖：
上圖中，我們可以看到，GLH芯片上蛋白活性較高，達到了85%，而傳統芯片上蛋白活性只有46%，也就是說，一大半蛋白在標記的過程中喪失了活性。GLH芯片上的蛋白活性高，意味著能結合analyte的分子更多，產生的信號更高，靈敏度也就更高。
