抗體藥物偶聯物ADC的作用機制、設計要素及選擇要求

ADC藥物簡介
抗體藥物偶聯物 (Antibody-Drug Conjugate, ADC) 是一種將高選擇性的單克隆抗體 (Monoclonal Antibody,mAb) 和強細胞毒性的小分子化學藥物即有效載荷 (Payload) 通過連接子 (Linker) 偶聯而獲得的藥物（圖1）。ADC結合了單抗對腫瘤細胞的靶向性以及細胞毒性藥物的強大腫瘤殺傷力，且克服了單抗的細胞毒性弱和細胞毒性藥物系統毒性大的問題，具有1+1>2的治療優勢。

ADC的作用機制復雜，通常需要藥物內化，然后進行細胞內處理和有效載荷釋放。ADC作用的典型模型假設如下：抗體與目標抗原的結合，隨后內化，經內體運輸進入溶酶體，在溶酶體中ADC的連接子或抗體部分降解并釋放出有效載荷，有效載荷則進一步發揮作用產生細胞毒性進而殺死腫瘤細胞。但實際情況更為復雜，并且ADC之間存在明顯差異（圖2）。

ADC藥物設計要素
1、靶抗原（Target Antigen）
ADC藥物設計起始于靶抗原，其選擇需滿足：
（1）特異性，腫瘤細胞高表達、正常細胞低表達或不表達；
（2）為腫瘤細胞表面抗原；
（3）能高效誘導內化過程等。

靶點蛋白的選擇直接關系到ADC的靶向性、治療效果以及安全性。愛必信深耕靶點蛋白研發領域，擁有超過 2800 種高質量靶點蛋白資源庫，其中ADC熱門靶點蛋白全覆蓋，廣泛應用于免疫原制備、高通量抗體篩選、細胞信號通路研究及功能機制驗證等場景。

大部分ADC藥物的療效主要基于內化后藥物釋放，即抗體與腫瘤細胞表面抗原結合形成的ADC-抗原復合物，需有效誘導內化，進入腫瘤細胞并經細胞內轉運和降解，實現小分子藥物釋放。通過細胞免疫熒光將ADC內化情況可視化（圖3），DT3C含量檢測定量內化效率（圖4）。

DT3C(Diphtheria Toxin Fragment A and Streptococcus Protein G C1, C2,C3)是一種重組表達的融合蛋白，該蛋白能夠與抗體的Fc端高度親和，與抗體結合的DT3C分子在抗體被內吞時一同進入細胞。DT3C可以與任何lgG型抗體結合，因此可用于檢測來自不同物種的抗體內化效率。

2、抗體（Antibody）
ADC藥物中的抗體需要滿足：高特異性、強靶點結合能力、低免疫原性、低交叉反應活性，以達到腫瘤細胞對ADC藥物更高效的攝入和ADC藥物在血清中更長的半衰期。

免疫球蛋白G (IgG) 是ADC中使用的主要抗體骨架。所以，臨床和臨床前研究的ADC藥物通常選擇IgG作為靶向目的抗原的抗體。IgGs可分為四個亞型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 。其中，IgG1由于能夠較好地平衡長血液半衰期和強免疫激活的關系，并且有著較高的自然豐度，是被研究和采用最多的ADC抗體。IgG4由于較低的免疫激活效應也經常被采用在一些對免疫原性反應要求較高的ADC藥物設計中。

圖5 不同IgG對比^[2]

3、有效載荷（Payload）
ADC所攜帶的細胞毒性載荷藥物即有效載荷是其最重要的效應成分。目前，常用的細胞毒性分子包括微管生成抑制劑、DNA 損傷因子和DNA轉錄抑制劑等。

選擇小分子藥物時，需要滿足：
（1）IC50值低至納摩爾級別甚至皮摩爾級別；
（2）在與抗體偶聯后不易引起ADC藥物發生聚集，以保證在體內擁有較長的循環時間；
（3）本身以及形成后的ADC藥物需具有較低的免疫原性；
（4）在水溶液（血液）中足夠穩定且具有合適的反應位點通過連接子與抗體偶聯，偶聯后仍然能夠保證其生物活性；
（5）可以通過相對具有經濟效益的過程合成。

4、連接子（Linker）
連接子（Linker）在ADC結果中起著至關重要的作用，其會影響ADC的藥代動力學參數、治療指數和藥效。Linker可維持ADC復合物在血流中的穩定性，并最大限度地減少非靶向效應。而且，在腫瘤細胞內化ADC的過程中，Linker應能夠快速釋放細胞毒性藥物。

根據可裂解性質Linker分為可裂解Linker和非可裂解Linker，可裂解Linker可進一步分為腙、二硫化物和肽Linker三種類型（表1）。非可裂解Linker包括不可降解的硫醚或馬來酰亞胺己酰基（Maleimidocaproyl，MC），其在ADC中Payload內化至靶癌細胞后經溶酶體酶降解。合理選擇和優化Linker及其與Payload的偶聯策略可有效提高ADC的治療效果和減少脫靶效應。

5、偶聯技術
偶聯技術將抗體與有效載荷相連，和最終的藥物抗體比率（Drug to Antibody Ratio, DAR）密切相關。DAR 為每個 mAb 連接的有效載荷平均數量，可經 HPLC - MS 等測得，對藥物藥理學和活性影響顯著，是 ADC 研發后期關鍵參數。因腫瘤細胞攝入 ADC 數量有限，較高 DAR 有利于提高效力，但小分子藥物疏水性強，DAR 過高會使 ADC 聚集，縮短體內循環半衰期且增加毒副作用，故臨床前和臨床用DAR 通常在 2 - 8 之間。

偶聯方式主要分為非定點偶聯和定點偶聯。早期使用的是非定點偶聯法，主要由賴氨酸或半胱氨酸偶聯。定點偶聯方式即通過基因工程位點進行特異性偶聯，實現更均一的ADC，能在特定位點實現細胞毒素的連接。

酶學偶聯法
Sortase A（abs05842）通過識別目標蛋白上的特定肽序列，通常是LPXTG（X可以是任何氨基酸），并在蘇氨酸（T）和甘氨酸（G）殘基之間進行切割（圖6）。Sortase A介導的抗體偶聯（SMAC）技術允許在抗體上預先設定的位點上高效地將毒素偶聯到抗體上，獲得DAR值均一且高度穩定的偶聯產物。

圖 6 轉肽酶/分選酶（Sortase）及轉肽反應

基于氮葡聚糖工程技術的偶聯策略
采用基于β-1,4-半乳糖基轉移酶（β-1,4-galactosyltransferase，GalT）和α-2，6-唾液酸轉移酶（α-2,6-sialyltransferase，SialT）的氮葡聚糖（N-Glycan）工程技術進行偶聯。在體外，可利用半乳糖基和唾液酸轉移酶的酶促反應引入末端唾液酸。這些唾液酸可經高碘酸鹽氧化產生醛基，并進一步通過肟鍵與Payload共價偶聯。該技術的主要優點在于：無論N-Glycan的異質性如何，該策略皆具有較高的可重復性，因此可用于含各種N-Glycan的任何mAb與Payload的偶聯。

愛必信ADC毒素抗體定點偶聯試劑盒（abs580253）操作簡便，無需抗體工程化等復雜操作，可快速實現單抗的定點偶聯。偶聯產物均一、穩定。適用于偶聯階段定點偶聯，ADC早期偶聯研究。

偶聯原理：
（1）抗體疊氮化修飾

首先使用糖苷酶（EndoS）暴露單抗恒定區的保守N糖鏈上的乙酰葡糖糖胺（藍色方塊），然后使用牛半乳糖轉移酶突變體（b.GalTY298L）將帶有疊氮官能團的乙酰半乳糖胺（黃色方塊-N3）連在乙酰葡萄糖胺上。

（2）毒素分子連接

隨后可使用無銅催化的炔疊氮化物環加成反應（如SPAAC）將生物素、熒光素或毒素分子（如：endo-BCN-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，abs823512）等連在單抗上。

驗證數據

ADC工藝開發、CMC和臨床前研究
ADC 藥物生產涵蓋抗體、細胞毒藥物/連接子、ADC 原料藥及制劑三大模塊，各模塊均需工藝開發與驗證，且要制定工程細胞、起始原料及試劑的質控要求。偶聯生產用中間體質控靈活，考驗工藝與質控體系研發能力，抗體和細胞毒素性質差異使生產挑戰大，工藝表征研究對后續批次意義重大。CMC 研究有 4 部分：1. 抗體；2. 載荷-連接子中間體；3. ADC原料藥；4. 制劑部分。同時，還應引入藥物抗體比率、連接位點、藥物負載分布等特殊質控指標，并控制游離載荷和抗體，研究其對結合效力及血漿穩定性的影響。

由于ADC的復雜性和多樣性，以及生物樣本中釋放的細胞毒藥物含量較低等原因，對藥代動力學 (PK) 和藥效學 (PD) 表征提出了獨特的挑戰。此外，在安全性評價中生物分析方法的選擇和檢測的準確性也是考量要素。

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參考文獻
[1] Kyoji Tsuchikama, et al. Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein Cell. 2018Jan;9(1):33-46
[2] Joshua Z Drago, et al. Unlocking the potential of antibody-drug conjugates for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jun;18(6):327-344.