InstiGRO CHO表達體系促進單克隆成活及增殖

01. 前 言
中國倉鼠卵巢（CHO）細胞株因其快速生長以及優秀的外源蛋白表達能力而常被選擇作為治療型蛋白的生產細胞株。然而，細胞培養在諸多環節仍存在瓶頸，例如轉染后恢復、單細胞分離后分裂、靜態轉震蕩培養等階段，細胞都會受到不同程度的壓力影響。尤其是在單細胞分離后細胞的代謝需求得不到滿足，會極大的影響克隆增殖，直接影響項目進程。

在這里，我們展示了來自安達望（Advanced Instruments）的促單細胞生長因子 InstiGRO CHO 及其增強版 InstiGRO CHO PLUS 解決因克隆擴增效果不佳而導致的細胞株開發低效問題的有效解決方案。InstiGRO CHO 及其增強版 InstiGRO CHO PLUS 使用無動物成分配方，旨在促進單細胞形成健康的克隆團，加速工藝流程。此外，安達望對 InstiGRO CHO PLUS 產品配方進一步優化，使得單克隆恢復率及克隆團生長速度方面有了進一步的提升，并且對某些表達特殊蛋白生長困難的克隆有顯著效果。

本文展示了康日百奧 CLD 團隊使用 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 優化已有平臺工藝的實驗結果。本實驗使用表達一種特定蛋白的 CHO-K1 細胞株，使用 VIPS^® 進行單細胞鋪板及 Cell Metric^® 進行單克隆成像，分別使用原工藝培養體系 CM A 以及 InstiGRO CHO+CM B、InstiGRO CHO PLUS+CM B 三個條件進行單克隆培養。通過平均克隆匯合度和平均克隆恢復率來判斷最優培養體系。我們發現使用 InstiGRO CHO 以及 InstiGRO CHO PLUS 時，克隆恢復率相對原工藝提高近 2 倍。使用 InstiGRO CHO 的平均克隆匯合度相對原工藝提高約 2 倍，而使用 InstiGRO CHO PLUS 的平均克隆匯合度相對原工藝提高約 8 倍。該結果證明，InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 能夠促進分離后的單細胞成活，增加單克隆恢復率，獲得更多陽性克隆。同時，它們還能促進克隆生長速度，縮短培養周期，加速工藝流程。

02. 材料與方法
我們選取表達一種特定蛋白的細胞株 CHO-K1，使用 VIPS 進行單細胞鋪板，將待鋪細胞密度稀釋到 8000-10000 cells/mL 進行單克隆鋪板，以保證鋪板效率。分別使用原有培養體系 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養條件，每個條件鋪 1 塊 96 孔板（康寧 3599）。

在鋪板后，培養板在 37°C 和 8% CO₂ 的條件下孵育 16 天。使用 Cell Metric^® 對培養板進行整板成像（從第 0 天到第 16 天）。在第 7、14 天，利用 Cell Metric 軟件進行匯合度分析。評估了第 7 天和第 14 天的克隆匯合度百分比，以及克隆恢復率。

03. 結 果
InsitGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 提高克隆恢復率并促進克隆增殖。
鋪板后分別對 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養條件進行克隆生長追蹤成像，第 16 天，統計形成明顯克隆團的單克隆孔數量，計算單克隆成活率（單克隆成活率（%）=成活單克隆孔數量/鋪入單克隆孔數量*100），如圖 1 所示，A-C 分別為 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個條件第 0 天鋪板結果示意圖，其中綠色孔為鋪入單細胞的孔，灰色孔為無細胞孔，紅色孔為鋪入多細胞的孔，平均鋪板率為 74%。D-F 為三個條件在第 16 天的整孔圖像，圖像顯示，添加 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 的單克隆生長相較于未添加 InstiGRO CHO 的單克隆生長更快，形成的克隆團更大；而添加 InstiGRO CHO PLUS 的單克隆生長相較于添加 InstiGRO CHO 的單克隆生長更快，形成的克隆團更大。

圖 1：A-C 分別為 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS+CM B 三個培養條件 VIPS 單細胞鋪板結果，紅色代表鋪入的多個細胞的孔，綠色代表鋪入單細胞的孔，灰色代表無細胞孔。

D-F 分別為 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS+CM B 三個培養條件第 16 天整孔成像結果，紅色叉號代表不計入統計的孔，綠色圓圈代表計入統計的單克隆來源的孔。

使用 Cell Metric 軟件匯合度算法，對克隆團匯合度自動計算，如圖 2 顯示，CM A，InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個條件在第 7 天匯合分別為 4.14%、3.96% 以及 4.42%，無顯著差別。克隆生長到第 16 天時，匯合度分別為 7.91%、16.74% 以及 61.96%，即添加 InstiGRO 試劑能夠顯著增加克隆團生長，且 InstiGRO CHO PLUS 相對于 InstiGRO CHO 效果更加明顯。

圖 2：CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養條件下第 7 天及第 16 天單克隆匯合度數據。藍色的代表第 7 天，橘色代表第 16 天。

此外，添加 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 的條件相較于未添加 InstiGRO CHO 的條件，單克隆數量更多，即克隆恢復率更高，如圖 3，原工藝下單克隆恢復率為 18.29%，添加 InstiGRO CHO 的條件單克隆恢復率為 31.42%，添加 InstiGRO CHO PLUS 的單克隆恢復率為 29.79%。

圖 3：CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養條件下第 16 天單克隆恢復率。

04. 結論與討論
在單克隆建系中，由于分離后單細胞獨自生長缺少共生長分泌因子，單克隆恢復率低是個普遍問題。InstiGRO CHO 以及 InstiGRO CHO PLUS 能夠促進單細胞成活，并加快單細胞生長。同時，它們可以幫助科學家們挑出更多的候選陽性克隆，并且能提早對克隆進行擴增，加速整體工作流程。

作者：
劉玉梅，劉星星；康日百奧生物科技（蘇州）有限公司
張倩倩；安達望（上海）科技有限公司