DNA-PAINT的超分辨率顯微技術原理和應用介紹
By Alexander Auer & Ralf Jungmann
超分辨率1 技術使研究人員能夠以前所未有的精度在光的經典衍射極限以下進行成像。在實施單分子定位的過程中，分子在非熒光暗狀態（或關閉狀態）和熒光亮狀態（或開啟狀態）之間“切換”，以便以亞衍射的精度選定和檢測它們的位置。通過獲取不僅單張而是一整疊圖像來構建超分辨率圖像，其中在“開啟狀態”中只記錄熒光分子的隨機子集（每幀都各不相同）。
最近推出的超分辨率方法 DNA-PAINT2 基于瞬態 DNA-DNA 相互作用。與 STORM3、PALM4 或 GSDIM5 等其他隨機方法相比，DNA-PAINT 技術中的熒光分子不會在暗態和亮態之間切換，所謂的“閃爍”是由短熒光 DNA 鏈與目標的瞬時雜交（結合和解除結合）產生的（圖 1a）。一旦成像鏈結合到對接位點，熒光團就會被固定，并且可以被相機檢測到。因為成像鏈是動態補充的，所以 DNA-PAINT 不會受到光漂白的影響，這允許在與對接位點結合時提取固定成像鏈的全部光子容量，從而促成低至幾納米的卓越分辨率6。高信號背景比使 DNA-PAINT 和共聚焦方法（如旋轉圓盤共聚焦顯微鏡7）相結合成為可能。我們用合成的 DNA 納米結構測試了一款新的非制冷型科學 CMOS 相機 (pco.panda 4.2 bi)。因此，我們裝飾了一個扁平矩形 的DNA 折紙，其中 DNA-PAINT 對接位點呈網格狀，間距為 10 nm（圖 1b），并使用全內反射熒光8 (TIRF) 顯微鏡對表面結合結構進行成像。單個結合位點可以以大約 1.5 nm 的精度定位，即為顯著的 FWHM 分辨率 ~3.6 nm（圖 1c）。
由于 DNA-PAINT 中 DNA 相互作用的可編程性質，多色圖像采集不僅限于光譜上的多重功能。一種稱為 exchange-PAINT9 的方法，讓使用同一種性能最佳的熒光染料來進行多重功能成像成為可能：成像鏈的 DNA 序列可以上偽色，其中每個正交序列代表一種獨特的顏色，然后按順序執行圖像采集，可以使用洗滌緩沖液去除瞬時結合的成像鏈，并且可以引入新的“顏色”（例如具有不同序列的成像鏈）。
超分辨率1 技術使研究人員能夠以前所未有的精度在光的經典衍射極限以下進行成像。在實施單分子定位的過程中，分子在非熒光暗狀態（或關閉狀態）和熒光亮狀態（或開啟狀態）之間“切換”，以便以亞衍射的精度選定和檢測它們的位置。通過獲取不僅單張而是一整疊圖像來構建超分辨率圖像，其中在“開啟狀態”中只記錄熒光分子的隨機子集（每幀都各不相同）。
圖 1：DNA 折紙的 DNA-PAINT 成像。(a) DNA-PAINT 原理：用熒光染料功能化的短寡核苷酸與位于靶標的互補 DNA 鏈（對接位點）瞬時結合。(b) 平面矩形 DNA 折紙用于 DNA-PAINT 成像，具有 4 x 4 網格圖案裝飾，間距 10 nm。(c) 用 DNA-PAINT 和 sCMOS 相機 (pco.panda 4.2) 成像的 n = 24 的DNA 折紙的總覽圖像。比例尺：20 nm (a)。
最近推出的超分辨率方法 DNA-PAINT2 基于瞬態 DNA-DNA 相互作用。與 STORM3、PALM4 或 GSDIM5 等其他隨機方法相比，DNA-PAINT 技術中的熒光分子不會在暗態和亮態之間切換，所謂的“閃爍”是由短熒光 DNA 鏈與目標的瞬時雜交（結合和解除結合）產生的（圖 1a）。一旦成像鏈結合到對接位點，熒光團就會被固定，并且可以被相機檢測到。因為成像鏈是動態補充的，所以 DNA-PAINT 不會受到光漂白的影響，這允許在與對接位點結合時提取固定成像鏈的全部光子容量，從而促成低至幾納米的卓越分辨率6。高信號背景比使 DNA-PAINT 和共聚焦方法（如旋轉圓盤共聚焦顯微鏡7）相結合成為可能。我們用合成的 DNA 納米結構測試了一款新的非制冷型科學 CMOS 相機 (pco.panda 4.2 bi)。因此，我們裝飾了一個扁平矩形 的DNA 折紙，其中 DNA-PAINT 對接位點呈網格狀，間距為 10 nm（圖 1b），并使用全內反射熒光8 (TIRF) 顯微鏡對表面結合結構進行成像。單個結合位點可以以大約 1.5 nm 的精度定位，即為顯著的 FWHM 分辨率 ~3.6 nm（圖 1c）。
由于 DNA-PAINT 中 DNA 相互作用的可編程性質，多色圖像采集不僅限于光譜上的多重功能。一種稱為 exchange-PAINT9 的方法，讓使用同一種性能最佳的熒光染料來進行多重功能成像成為可能：成像鏈的 DNA 序列可以上偽色，其中每個正交序列代表一種獨特的顏色，然后按順序執行圖像采集，可以使用洗滌緩沖液去除瞬時結合的成像鏈，并且可以引入新的“顏色”（例如具有不同序列的成像鏈）。
圖 2：細胞環境中的 DNA-PAINT 成像。(a) 微管用 α 微管蛋白一抗和 DNA 偶聯二抗標記。使用非制冷型 sCMOS 相機 (pco.panda 4.2) 在 TIRF 模式下進行成像。(b) 衍射限制 (DL) 表示和圖 (c) a 中突出顯示區域的超分辨率 (SR) 放大。(d)圖 (c) 中標記區域的橫截面直方圖顯示了三個微管中間纖維之間的距離。比例尺：5 μm (a), 500 nm (b, c)。
為了使用 DNA-PAINT 對細胞成分進行成像，標記探針（例如抗體 10、納米抗體 11 或 Affimers12）與作為對接位點的短 DNA 寡核苷酸結合。我們研究了非制冷型 sCMOS 相機在固定 COS7 細胞的細胞環境中的成像能力，其中 α 微管蛋白用一抗和二抗標記（圖 2）。概覽（圖 2a）顯示了超分辨微管網絡。圖 2b 中衍射受限的放大面板與圖 2c 中的超分辨率放大面板的對比清楚地顯示了分辨率的增加，從而可以區分和測量單個微管蛋白纖維絲之間的距離（圖 2d）。顯然，非制冷型 sCMOS 相機非常適合使用 DNA-PAINT 方法進行此類超分辨率測量。
尾注：
1 Hell, S.W., et al., The 2015 super-resolution microscopy roadmap. Journal of Physics D-Applied Physics, 2015. 48(44).
2 Jungmann, R., et al., Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett, 2010. 10(11): p. 4756-61.
3 Rust, M.J., M. Bates, and X.W. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, 2006. 3(10): p. 793-795.
4 Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793): p. 1642-1645.
5 Folling, J., et al., Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods 5 (2008), p. 943-945.
6 Dai, M., DNA-PAINT Super-Resolution Imaging for Nucleic Acid Nanostructures. Methods Mol Biol, 2017. 1500: p. 185-202.
7 Schueder, F., et al., Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 2090.
8 Axelrod, D., Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol, 1981. 89(1): p. 141-5.
9 Jungmann, R., et al., Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNAPAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods, 2014. 11(3): p. 313-8.
10 Schnitzbauer, J., et al., Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc, 2017. 12(6): p. 1198-1228.
11 Agasti, S.S., et al., DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange- PAINT imaging. Chem Sci, 2017. 8(4): p. 3080-3091.
12 Schlichthaerle, T., et al., Site-specific labeling of Affimers for DNA-PAINT microscopy. Angew Chem Int Ed Engl, 2018.
【關于埃賽力達科技Excelitas Technologies Corp.】
埃賽力達是一家技術經驗豐富供應商，致力于提供先進的、改善生活的革新技術，為生命科學、先進工業、新一代半導體、航空航天等各終端市場的全球企業提供服務。公司總部位于美國賓夕法尼亞州匹茲堡。埃賽力達是光子技術設計、開發和制造領域的重要合作伙伴，為全球客戶提供傳感、檢測、成像、光學和特種光源方面的前沿創新技術。
廣州市元奧儀器有限公司作為埃賽力達在國內的一級代理商，根據用戶的不同需求提供具備高性能、高質量的產品，為客戶提供專業的方案，歡迎咨詢！
為了使用 DNA-PAINT 對細胞成分進行成像，標記探針（例如抗體 10、納米抗體 11 或 Affimers12）與作為對接位點的短 DNA 寡核苷酸結合。我們研究了非制冷型 sCMOS 相機在固定 COS7 細胞的細胞環境中的成像能力，其中 α 微管蛋白用一抗和二抗標記（圖 2）。概覽（圖 2a）顯示了超分辨微管網絡。圖 2b 中衍射受限的放大面板與圖 2c 中的超分辨率放大面板的對比清楚地顯示了分辨率的增加，從而可以區分和測量單個微管蛋白纖維絲之間的距離（圖 2d）。顯然，非制冷型 sCMOS 相機非常適合使用 DNA-PAINT 方法進行此類超分辨率測量。
尾注：
1 Hell, S.W., et al., The 2015 super-resolution microscopy roadmap. Journal of Physics D-Applied Physics, 2015. 48(44).
2 Jungmann, R., et al., Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett, 2010. 10(11): p. 4756-61.
3 Rust, M.J., M. Bates, and X.W. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, 2006. 3(10): p. 793-795.
4 Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793): p. 1642-1645.
5 Folling, J., et al., Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods 5 (2008), p. 943-945.
6 Dai, M., DNA-PAINT Super-Resolution Imaging for Nucleic Acid Nanostructures. Methods Mol Biol, 2017. 1500: p. 185-202.
7 Schueder, F., et al., Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 2090.
8 Axelrod, D., Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol, 1981. 89(1): p. 141-5.
9 Jungmann, R., et al., Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNAPAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods, 2014. 11(3): p. 313-8.
10 Schnitzbauer, J., et al., Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc, 2017. 12(6): p. 1198-1228.
11 Agasti, S.S., et al., DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange- PAINT imaging. Chem Sci, 2017. 8(4): p. 3080-3091.
12 Schlichthaerle, T., et al., Site-specific labeling of Affimers for DNA-PAINT microscopy. Angew Chem Int Ed Engl, 2018.
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