新型成像技術(shù)快速解析細(xì)胞分布與腫瘤異質(zhì)性

PRISM（Profiling of RNA In-situ through Single-round iMaging）是一種新型的高復(fù)用空間RNA成像技術(shù)，它通過顏色強(qiáng)度條形碼策略，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡下實(shí)現(xiàn)單輪成像即可檢測多達(dá)64種RNA轉(zhuǎn)錄本。該方法利用滾動圈擴(kuò)增（RCA）和競爭性雜交原理，將熒光信號的強(qiáng)度分級與多通道光譜結(jié)合，克服了傳統(tǒng)顯微鏡僅能分辨有限通道的瓶頸。PRISM技術(shù)無需復(fù)雜的流體學(xué)設(shè)備，整個工作流程可在一天內(nèi)完成，顯著降低了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)門檻。研究團(tuán)隊(duì)在多個組織樣本中驗(yàn)證了PRISM的實(shí)用性，包括小鼠胚胎發(fā)育圖譜、人類肝癌微環(huán)境分析以及小鼠腦組織的3D成像，揭示了細(xì)胞類型分布、亞細(xì)胞RNA定位及腫瘤異質(zhì)性等關(guān)鍵生物學(xué)信息。該技術(shù)的高通量、高分辨率和易用性，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具。

本研究的核心貢獻(xiàn)者包括Tianyi Chang、Shihui Zhao、Kunyue Deng、Zhizhao Liao、Mingchuan Tang、Yanxi Zhu、Wuji Han、Chenxi Yu、Wenyi Fan、Mengcheng Jiang、Guanbo Wang、Dongfang Liu、Jirun Peng、Yuhong Pang、Peng Fei、Jianbin Wang、Chunhong Zheng和Yanyi Huang。研究成果以論文“High-plex spatial RNA imaging in one round with conventional microscopes using color-intensity barcodes”的形式，于2025年10月在《Nature Biotechnology》上發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
01PRISM技術(shù)原理與工作流程
PRISM技術(shù)的核心在于通過顏色強(qiáng)度條形碼對RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行編碼。每個靶基因的padlock探針包含多個片段，每個片段對應(yīng)一個熒光通道（如Texas Red、Alexa Fluor 488、Cy5、Cy3），并通過混合標(biāo)記與未標(biāo)記成像探針的比例，實(shí)現(xiàn)熒光強(qiáng)度的分級量化。這種設(shè)計使得在有限的光譜通道內(nèi)（如3-4個通道），通過強(qiáng)度組合可產(chǎn)生大量可區(qū)分的條形碼。例如，將三個通道分為五級強(qiáng)度（0-4/5），并結(jié)合第四個通道的雙級強(qiáng)度，理論編碼容量可達(dá)64種基因。關(guān)鍵創(chuàng)新是半徑向量過濾策略，確保條形碼在顏色空間中的角度分散，避免因擴(kuò)增產(chǎn)物大小不均導(dǎo)致的信號混淆。

工作流程從padlock探針與靶RNA結(jié)合開始，經(jīng)過連接和滾動圈擴(kuò)增，產(chǎn)生大量相同的條形碼序列。隨后，通過單輪混合成像探針染色，利用競爭性雜交使每個片段按預(yù)設(shè)比例顯示熒光強(qiáng)度。成像后，信號點(diǎn)被提取并投影到顏色空間，通過高斯擬合或手動邊界劃分進(jìn)行條形碼解碼。該方法在傳統(tǒng)顯微鏡下即可實(shí)現(xiàn)，無需多輪反應(yīng)，減少了樣本變形和配準(zhǔn)誤差。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，PRISM的解碼準(zhǔn)確率超過95%，且對組織自發(fā)熒光有良好魯棒性。

在小鼠胚胎發(fā)育研究中，PRISM生成了E12.5至E14.5階段的3D細(xì)胞圖譜，涵蓋了超過425萬個細(xì)胞，分為12種主要類型。研究揭示了神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、運(yùn)動系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等器官的發(fā)育動態(tài)，例如脊髓中Hoxb8、Robo2和Stmn2基因的共表達(dá)，以及肢體發(fā)育中Wnt5a+和Tbx5+細(xì)胞的空間相關(guān)性。細(xì)胞互作分析顯示，肝細(xì)胞中94%存在近距離相互作用，表明胚胎期肝小葉結(jié)構(gòu)的早期形成。

在人類肝癌樣本中，PRISM使用31個基因 panel（包括HBV核心蛋白編碼序列），分析了約120萬個細(xì)胞，識別出32種細(xì)胞類型，如腫瘤細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）和免疫細(xì)胞亞型。空間分析揭示了腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性，例如CAFs形成物理屏障阻礙免疫細(xì)胞浸潤，以及B細(xì)胞在3D空間中形成淋巴樣網(wǎng)絡(luò)。這些發(fā)現(xiàn)為肝癌免疫治療提供了新見解。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
PRISM技術(shù)的核心創(chuàng)新在于突破了傳統(tǒng)光學(xué)成像的多路復(fù)用限制。常規(guī)熒光顯微鏡受限于光譜重疊，通常只能分辨4-5個通道，而PRISM通過顏色強(qiáng)度分級，將編碼容量提升至64重，無需超分辨率或?qū)Ｓ迷O(shè)備。這種“單輪成像”策略避免了多輪標(biāo)記-剝離反應(yīng)帶來的樣本損傷和配準(zhǔn)難題，顯著提高了實(shí)驗(yàn)效率和可重復(fù)性。此外，PRISM采用半徑向量過濾優(yōu)化條形碼區(qū)分度，并通過調(diào)整熒光探針比例適應(yīng)不同光學(xué)系統(tǒng)，展現(xiàn)了高度的靈活性和魯棒性。

在生物醫(yī)學(xué)價值方面，PRISM降低了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)門檻，使普通實(shí)驗(yàn)室也能開展高通量空間RNA分析。它成功應(yīng)用于胚胎發(fā)育、腫瘤微環(huán)境和神經(jīng)科學(xué)等多個領(lǐng)域，提供了細(xì)胞互作、亞細(xì)胞定位和3D結(jié)構(gòu)的全新見解。例如，在肝癌研究中，PRISM揭示了CAFs的屏障作用和免疫細(xì)胞空間異質(zhì)性，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供了潛在靶點(diǎn)。技術(shù)開源性進(jìn)一步促進(jìn)了廣泛采用，有望推動分子病理學(xué)和細(xì)胞圖譜構(gòu)建的普及。

總結(jié)與展望
PRISM技術(shù)通過顏色強(qiáng)度條形碼實(shí)現(xiàn)了高效、易用的空間RNA成像，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)大工具。它克服了傳統(tǒng)顯微鏡的通道限制，并在多種組織類型中驗(yàn)證了其可靠性和廣泛應(yīng)用潛力。未來，PRISM可通過結(jié)合光激活染料或膨脹顯微鏡進(jìn)一步提升復(fù)用能力和分辨率。雖然目前靈敏度較低（約10%），但通過增加靶基因探針數(shù)量有望改善。隨著技術(shù)優(yōu)化和社區(qū)推廣，PRISM有望成為空間生物學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)，推動疾病機(jī)制研究和臨床診斷創(chuàng)新。

DOI:10.1038/s41587-025-02883-7.