RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀在大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法中的應(yīng)用

方案摘要：本方案圍繞大腸埃希氏菌檢測(cè)流程優(yōu)化，深度融合 RAYPA 培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀核心優(yōu)勢(shì)，提升檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性。培養(yǎng)基制備環(huán)節(jié)，儀器可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)加熱溶解、48℃±2℃精準(zhǔn)控溫及 15-20mL / 皿定量分裝，避免人工操作導(dǎo)致的濃度不均、溫度波動(dòng)等問題。儀器保障培養(yǎng)基均一性，讓藍(lán)綠色典型菌落更易識(shí)別，結(jié)合規(guī)范計(jì)數(shù)規(guī)則，顯著提升結(jié)果重復(fù)性。整體方案通過自動(dòng)化升級(jí)，簡(jiǎn)化操作步驟、減少人為誤差，為大腸埃希氏菌檢測(cè)提供高效可靠的解決方案。
 
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       通過梯度稀釋樣品，降低菌液濃度以避免菌落重疊，再將稀釋液接種至選擇性培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可抑制雜菌生長(zhǎng)，僅允許大腸埃希氏菌繁殖，培養(yǎng)后單個(gè)或一群大腸埃希氏菌形成可見菌落。通過計(jì)數(shù)符合特征的菌落，結(jié)合菌落形成單位（CFU）換算樣品中該菌濃度，同時(shí)借助生化反應(yīng)確認(rèn)菌種，確保計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確。
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
① RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀;
② Pipetty Pro 非等量電動(dòng)移液器:MSIC12-01-1000;
③ 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒溫水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
⑥ 恒溫裝置:48 ℃±2℃;
⑦ 天平:感量 0.1g;
⑧ 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯,振蕩器;
⑨ 試管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm 、以及小倒管(杜氏管）;
 ⑩ 無菌錐形瓶:容量 500 mL;
⑪ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm;
⑫ pH 計(jì)或精密 pH 試紙;
 ⑬ 無菌接種環(huán):10 μL。
 
2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液;
② 生理鹽水;
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯;
④ EC 肉湯;
⑤ 胰蛋白胨膽鹽 X-葡萄糖醛酸苷(TBX)瓊脂;
⑥ 1 mol/I NaOH;
⑦ 1 mol/L HCl。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣品的稀釋
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min~10 000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min;或放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min,制成 1:10 的樣品勻液。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶中充分混勻,或放入盛有 225ml,磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2 min,制成1:10的樣品勻液。
③ 必要時(shí)用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HC1,調(diào)節(jié)樣品勻液或液體樣品原液的 pH 至 6.5~7.5。
④ 用Pipetty電動(dòng)移液器吸取1:10 樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入裝有9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中,將試管在振蕩器上振蕩混勻,制成1:100的樣品勻液。
 
⑤ 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),依次制成 10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支無菌吸頭。
2、樣品接種準(zhǔn)備
根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選取2個(gè)~3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液。使用Pipetty電動(dòng)移液器，向每個(gè)選定稀釋度對(duì)應(yīng)的2個(gè)無菌培養(yǎng)皿中各接種1mL樣品勻液。同時(shí)，取磷酸鹽緩沖液或生理鹽水1mL加入2個(gè)無菌培養(yǎng)皿作為空白對(duì)照。
3、培養(yǎng)基制備與傾注培養(yǎng)
① 培養(yǎng)基制備：將TBX瓊脂干粉與定量無菌水按配方比例加入RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀內(nèi)，通過儀器觸控屏設(shè)定制備參數(shù)。儀器可實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的自動(dòng)加熱溶解、精準(zhǔn)控溫?cái)嚢瑁�確保瓊脂完全溶解且濃度均勻，避免人工制備時(shí)因加熱不均導(dǎo)致的培養(yǎng)基質(zhì)量波動(dòng)。
 
② 溫度精準(zhǔn)控制：儀器內(nèi)置高精度溫控系統(tǒng)，可將制備完成的TBX瓊脂自動(dòng)恒溫至48℃±2℃的最佳傾注溫度，無需人工反復(fù)測(cè)溫調(diào)整，徹底解決傳統(tǒng)水浴控溫效率低、溫度波動(dòng)大的問題。
③ 自動(dòng)分裝傾注：在接種完成后，通過儀器觸控屏設(shè)定分裝體積（15mL~20mL/皿），啟動(dòng)自動(dòng)分裝程序。儀器的精準(zhǔn)分裝泵保證各培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基厚度一致，為菌落生長(zhǎng)提供均一環(huán)境，并避免人工接觸造成的污染。
 
④ 混勻與凝固：將培養(yǎng)皿進(jìn)行輕柔旋轉(zhuǎn)混勻，確保培養(yǎng)基與接種的樣品勻液充分接觸且無氣泡產(chǎn)生；隨后將培養(yǎng)皿水平靜置，待其凝固。
⑤ 培養(yǎng)銜接：瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于36℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h~24h。若采用RAYPA儀器配套的一體化培養(yǎng)模塊，可直接通過儀器設(shè)定培養(yǎng)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)從分裝到培養(yǎng)的無縫銜接，進(jìn)一步提升操作效率。
4、平板菌落數(shù)的選擇
TBX瓊脂平板上大腸埃希氏菌的典型菌落為藍(lán)綠色,選擇典型菌落數(shù)在 15 CFU~150 CFU 之間的平板,對(duì)典型菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。
5、大腸埃希氏菌菌落數(shù)的計(jì)算
① 若只有1個(gè)稀釋度的平板上典型菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍內(nèi),以該稀釋度典型菌落數(shù)的平均值,再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。
② 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板上典型菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),結(jié)果按式(1)計(jì)算:
 
③ 若所有稀釋度的平板上典型菌落數(shù)均大于 150 CFU,則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),其他稀釋度的平板菌落數(shù)可記錄為多不可計(jì),結(jié)果按最高稀釋度典型菌落數(shù)的平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算。
④ 若所有稀釋度的平板上典型菌落數(shù)均小于15 CFU,則對(duì)稀釋度最低的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果按最低稀釋度典型菌落數(shù)的平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算。
⑤ 若所有稀釋度平板均無典型菌落生長(zhǎng),則結(jié)果按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
⑥ 若所有稀釋度的平板上典型菌落數(shù)均不在 15 CFU~150 CFU之間,其中一部分小于 15 CFU一部分大于 150 CFU 時(shí),則以最接近 15 CFU或 150 CFU 的典型菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。
 
四、結(jié)果報(bào)告
1、大腸埃希氏菌的菌落數(shù)小于 100 CFU 時(shí),按“四舍五入”的原則修約,以整數(shù)報(bào)告。
2、大腸埃希氏菌的菌落數(shù)大于或等于 100 CFU時(shí),第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2 位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數(shù)字。
3、若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng),則此次檢驗(yàn)結(jié)果無效。
4、稱重取樣以 CFU/g為單位報(bào)告結(jié)果,體積取樣以 CFU/ml, 為單位報(bào)告結(jié)果。