通過鈰摻雜上轉(zhuǎn)換抗氧化納米酶阻斷脊髓損傷的單細(xì)胞多組學(xué)評估

期刊：Advanced Science
影響因子：14.1
主要技術(shù)：snRNA-seq、snATAC-seq

導(dǎo)語
脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）而引起髓鞘退化，進(jìn)一步阻礙功能的恢復(fù)。基于鈰（Ce）摻雜的上轉(zhuǎn)換抗氧化納米酶，設(shè)計(jì)了用于SCI的同時(shí)緊急治療和動態(tài)發(fā)光嚴(yán)重性評估（SETLSA）策略（Ce@UCNP-BCH）。 Ce@UCNP-BCH不僅可以有效地消除SCI局部的ROS，而且可以使用比率發(fā)光信號動態(tài)監(jiān)測SCI修復(fù)過程中的氧化狀態(tài)。經(jīng)典basso小鼠量表評分和免疫熒光分析共同顯示Ce@UCNP-BCH有效促進(jìn)包括髓鞘在內(nèi)脊髓的再生，并促進(jìn)SCI小鼠的功能恢復(fù)。本研究結(jié)合snATAC-seq和snRNA-seq揭示了Ce@UCNP-BCH治療后脊髓組織的異質(zhì)性。研究結(jié)果揭示了髓鞘形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加，以及髓鞘形成相關(guān)基因的表達(dá)增加，該研究還揭示了治療后髓鞘再生的基因調(diào)控動力學(xué)。此外，ETLSA策略在SOD-siRNA治療后通過超氧化物歧化酶（SOD）相關(guān)途徑協(xié)同促進(jìn)ROS消耗。總之，這種同時(shí)阻斷和動態(tài)監(jiān)測氧化應(yīng)激的SETLSA策略豐富了促進(jìn)SCI修復(fù)的工具包。

主要技術(shù)
scRNA-seq、snRNA-seq

研究結(jié)果
1. e@UCNP-BCH的合成與表征
透射電鏡（TEM）顯示，Ce@UCNP及其負(fù)載BCH后的Ce@UCNP-BCH均呈均勻的球形，尺寸約為100 nm，且形貌未發(fā)生明顯改變。元素映射和X射線光電子能譜（XPS）證實(shí)了釔（Y）、鐿（Yb）、鉺（Er）和鈰（Ce）的成功摻雜。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）證明了BCH特征官能團(tuán)的存在，表明BCH已成功負(fù)載到納米顆粒上。光譜分析表明，BCH的吸收峰（647 nm）與UCNPs在650 nm的發(fā)射峰高度重疊，滿足了LRET的條件。當(dāng)存在H₂O₂時(shí)，BCH的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，吸收峰藍(lán)移至414 nm，導(dǎo)致其對650 nm發(fā)光的淬滅效應(yīng)解除，從而使I₆₅₀信號恢復(fù)，同時(shí)I₆₉₀信號減弱。這一變化構(gòu)成了比率型熒光信號（I₆₅₀/I₆₉₀）的基礎(chǔ)。通過H₂O₂清除實(shí)驗(yàn)和電子順磁共振（EPR）波譜分析，證明Ce@UCNP-BCH能有效清除H₂O₂和超氧陰離子（O₂•⁻），且呈劑量依賴性。

Scheme 1.通過Ce@UCNP-BCH改善SCI促進(jìn)了實(shí)時(shí)發(fā)光和單細(xì)胞多組學(xué)評估

Fig 1. Ce@UCNP-BCH的特性數(shù)據(jù)

2. CeO2 NPs和Ce@UCNP的體外ROS清除性能和神經(jīng)保護(hù)能力
研究在細(xì)胞層面系統(tǒng)評估了納米材料的生物活性。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，CeO₂ NPs、Ce@UCNP及Ce@UCNP-BCH在有效濃度范圍內(nèi)對HT-22細(xì)胞和海馬神經(jīng)元無明顯毒性。在谷氨酸損傷的HT-22細(xì)胞模型中，DCFH-DA和DHE染色顯示，CeO₂ NPs和Ce@UCNP均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS和O₂⁻水平。對損傷后的海馬神經(jīng)元，CeO₂ NPs和Ce@UCNP處理能顯著增加神經(jīng)突起的長度和分支數(shù)量，其中CeO₂ NPs在10 μg/mL、Ce@UCNP在1.5-3 μg/mL時(shí)效果最佳。在受損程度不同的神經(jīng)元中，Ce@UCNP-BCH的熒光信號（I₆₅₀/I₆₉₀）能準(zhǔn)確反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。同時(shí)，它同樣展現(xiàn)出促進(jìn)神經(jīng)突起再生的能力，實(shí)現(xiàn)了“在治療中監(jiān)測，在監(jiān)測下治療”。

Fig 2. 用Ce@UCNP-BCH檢測氧化還原狀態(tài)和恢復(fù)神經(jīng)行為

3. Ce@UCNP-BCH的上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像和體內(nèi)活性氧清除
在小鼠SCI模型中，Ce@UCNP-BCH的綜合治療效果得到全面驗(yàn)證。向SCI小鼠腹腔注射Ce@UCNP-BCH后，通過活體成像系統(tǒng)監(jiān)測損傷部位的熒光信號。結(jié)果顯示，在損傷后24小時(shí)內(nèi)，I₆₅₀/I₆₉₀比值持續(xù)升高，并于24小時(shí)達(dá)到峰值，直觀反映了損傷部位ROS的動態(tài)累積過程。利用L-012化學(xué)發(fā)光探針進(jìn)行在體成像，發(fā)現(xiàn)Ce@UCNP和Ce@UCNP-BCH治療組小鼠損傷部位的ROS信號強(qiáng)度顯著低于損傷組，證明其強(qiáng)大的體內(nèi)抗氧化能力。ELISA檢測顯示，治療組小鼠血清中的促炎細(xì)胞因子（IL-6, TNF-α, IL-1β）水平顯著降低。治療組小鼠的后肢運(yùn)動功能評分顯著高于損傷組。治療組小鼠的運(yùn)動速度和總移動距離顯著增加。治療組小鼠的步長和步寬均更接近正常小鼠，表明其步態(tài)得到明顯改善。對脊髓組織的直接觀察為功能恢復(fù)提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。H&E和LFB染色顯示，與損傷組相比，治療組的脊髓組織空洞更小，結(jié)構(gòu)更完整，髓鞘保留得更多。TUNEL染色顯示，治療組損傷部位的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少。NeuN/BrdU共染色顯示，治療組中成熟的神經(jīng)元（NeuN⁺）和新增殖的神經(jīng)元（BrdU⁺）數(shù)量更多，表明Ce@UCNP-BCH不僅能保護(hù)現(xiàn)有神經(jīng)元，還能促進(jìn)神經(jīng)再生。NFH/GFAP共染色顯示，治療組中神經(jīng)絲（NFH，標(biāo)記神經(jīng)元軸突）的信號增強(qiáng)，而膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，標(biāo)記活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，形成膠質(zhì)瘢痕）的信號減弱，說明治療創(chuàng)造了更利于軸突再生的微環(huán)境。

Fig 3. Ce@UCNP-BCH的體內(nèi)ROS清除和治療作用

4. 脊髓損傷后細(xì)胞分子變化與治療的對比分析
以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明了Ce@UCNP-BCH治療SCI的整體療效，包括促進(jìn)脊髓修復(fù)、改善運(yùn)動功能、清除ROS等，然而，SCI后，組織內(nèi)的原位異質(zhì)性增加。存在的細(xì)胞亞群可能表現(xiàn)出不同的反應(yīng)和恢復(fù)能力。為了闡明Ce@UCNP-BCH，來自假手術(shù)、損傷和治療組的小鼠用于收集亞急性期（10 dpi）的脊髓用于snATAC-seq和snRNA-seq（BGI DNBelab C4）。實(shí)施了標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)預(yù)處理程序。最后，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和過濾，snATAC-seq中獲得129549個(gè)細(xì)胞，snRNA-seq中獲得39442個(gè)細(xì)胞。在snRNA-seq中鑒定了31種細(xì)胞類型，在snATAC-seq中鑒定了33種細(xì)胞類型。貝葉斯模型分析顯示，與損傷組相比，治療組中髓鞘形成少突膠質(zhì)細(xì)胞（MFOLs） 的數(shù)量顯著增加。這表明治療有效促進(jìn)了髓鞘的再生。熱圖分析顯示，治療組MFOLs中髓鞘相關(guān)基因（Plp1, Apod, Trf） 和神經(jīng)再生相關(guān)基因（Bdnf） 的表達(dá)顯著上調(diào)。GSEA表明，治療激活了氧化磷酸化、心肌收縮等代謝通路，為軸突再生和髓鞘合成提供了充足的能量。

Fig 4. 脊髓單細(xì)胞圖譜以及不同條件下細(xì)胞類型和基因表達(dá)的差異

5. Ce@UCNP-BCH促進(jìn)神經(jīng)元再生和髓鞘形成
通過整合snATAC-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)治療雖然未顯著改變Olig1等關(guān)鍵基因啟動子區(qū)的染色質(zhì)可及性，但可能通過激活轉(zhuǎn)錄因子（如Sp1, Klf7, Egr1）的活性，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)了這些基因的表達(dá)，驅(qū)動了髓鞘再生。

Fig 5. 處理后髓鞘再生的基因調(diào)控動力學(xué)

6. Ce@UCNP-BCH的治療作用機(jī)制
通過蛋白組學(xué)和功能喪失/獲得實(shí)驗(yàn)，鎖定了關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。通過LC-MS/MS比較損傷組與治療組的蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶2（SOD2）是唯一一個(gè)在“細(xì)胞氧化解毒”、“對氧水平升高的反應(yīng)”和“氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡”三條通路中均出現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白。Western blot和免疫熒光證實(shí)，在損傷組中SOD2蛋白表達(dá)量代償性升高，而在治療組中其表達(dá)量回落至接近正常水平，提示Ce@UCNP-BCH通過增強(qiáng)SOD2的酶活性而非促進(jìn)其表達(dá)來清除ROS。在海馬神經(jīng)元中過表達(dá)SOD2，能模擬Ce@UCNP-BCH的神經(jīng)修復(fù)作用，且兩者聯(lián)合使用時(shí)效果更佳。使用SOD2-SiRNA敲低SOD2或抑制劑2-MeOE2后，Ce@UCNP-BCH的治療效果被顯著削弱。電生理學(xué)檢測也顯示，抑制劑處理阻斷了治療帶來的運(yùn)動誘發(fā)電位（MEP）振幅的改善。

Fig 6. Ce@UCNP-BCH體外神經(jīng)修復(fù)行為的機(jī)制研究

參考文獻(xiàn)：
Wang K, Zheng J, Li R, Chen T, Ma Y, Wu P, Luo J, Zhu J, Lin W, Zhao M, Yuan Y, Ma W, Lin X, Wang Y, Liu L, Gao P, Lin H, Liu C, Liao Y, Ji Z. Single-Cell Multi-omics Assessment of Spinal Cord Injury Blocking via Cerium-doped Upconversion Antioxidant Nanoenzymes. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb;12(8):e2412526. doi: 10.1002/advs.202412526. Epub 2025 Jan 9. PMID: 39783786; PMCID: PMC11848599.