WB實際條帶與預(yù)期不符的原因分析及解決辦法

1、目的蛋白以其他形式存在，最常見的情況
● 翻譯后修飾：如糖基化，常見接受糖基化的氨基酸是絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)和羥賴氨酸(Hydroxylysine)，例如CD2，根據(jù)uniprot顯示，其預(yù)測分子量應(yīng)該在39kda左右，但是表觀分子量一般在45kDa左右，這是由于CD2多個位點存在糖基化修飾，實際實驗中，如果想探究分子量差異是否是由糖基化引起的，可以加入糖苷酶PNGase F切去糖基后，進行WB，而除了糖基化以外，還存在磷酸化，泛素化、甲基化、乙酰化等多種翻譯后修飾。其中，糖基化、乙酰化、甲基化通常是使表觀分子量變大，磷酸化通常不變或變大。

CD2理論分子量39kDa左右

表觀分子量45kDa左右

Uniprot中顯示CD2的糖基化

● 剪切：如Caspase-7存在多種形式：
1）Procaspase-7：Caspase-7的前體形式，分子量約為37kDa；
2）Intermediate caspase-7：中間形式的Caspase-7，分子量約為28kDa；
3）Caspase-7 p20：活化的Caspase-7的片段之一，分子量約為20kDa。

Procaspase-7是Caspase-7的未活化前體形式，具有較大的分子量。當(dāng)細胞受到凋亡信號刺激時，procaspase通過自身切割或被其他caspase（如initiator caspases）切割激活，形成較小的活性亞單位這些亞單位結(jié)合在一起形成有活性的異二聚體。這種情況可以設(shè)置誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組進行驗證。剪切后的表觀分子量會變小。

Caspase-7兔單克隆抗體的WB結(jié)果
泳道1: HeLa全細胞裂解物20ug
泳道2: Jurkat全細胞裂解物20ug
泳道3: HEK-293全細胞裂解物20ug
二抗：山羊抗兔IgG,(H+L),1/10000稀釋時綴合的HRP
預(yù)測分子量：34kDa
觀察分子量：28,35kDa
暴露時間：180s

● 多聚體和共價結(jié)合聚體：如果表觀分子量和預(yù)測分子量呈現(xiàn)倍數(shù)增長，需要考慮是否是多聚體，添加還原劑如DTT可以驗證是否為非共價結(jié)合聚體。

2、蛋白異常遷移
● 對于分子量小于20kDa的蛋白
傳統(tǒng)的Tris-Glycine體系在用于SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）時，對于小分子量蛋白質(zhì)的分離效果不佳，主要原因在于以下幾個方面：

1）離子前峰的影響：在Tris-Glycine體系中，濃縮膠通常使用pH6.8的Tris-HCl緩沖液，而電泳緩沖液和分離膠則使用pH8.3左右的Tris-Glycine緩沖液。當(dāng)電泳開始時，甘氨酸(Glycine)在濃縮膠中的解離度較低，移動速度慢，形成一個移動的離子前峰。隨著電場的作用，甘氨酸逐漸解離并加速移動，在這個過程中會產(chǎn)生大量的自由十二烷基硫酸根離子(DS-)，這些離子會與小分子量蛋白結(jié)合，導(dǎo)致它們聚集或變性，從而影響分辨率；

2）低分子量蛋白質(zhì)的遷移問題：由于上述原因，小分子量蛋白質(zhì)在通過濃縮膠進入分離膠的過程中可能會受到阻礙，導(dǎo)致條帶模糊、拖尾或分辨率降低。特別是在分離小于20kDa的蛋白質(zhì)或多肽時，這種現(xiàn)象尤為明顯；

3）緩沖系統(tǒng)pH值的影響：Tris-Glycine系統(tǒng)的pH值較高，這可能導(dǎo)致小分子量蛋白質(zhì)在電泳過程中的某些修飾或降解，進一步影響其分離效果。

因此推薦使用Tricine-SDS-PAGE體系對20kDa以下的小分子量蛋白質(zhì)或多肽進行分離。Tricine作為電泳緩沖液成分之一，其pKa值較低(8.15)，使得它在電泳過程中不會像甘氨酸那樣產(chǎn)生大量的游離DS-離子，從而減少了對小分子量蛋白質(zhì)的影響，并且能夠提供更高的分辨率。此外，Tricine-SDS-PAGE通常采用較低濃度的丙烯酰胺凝膠，以適應(yīng)小分子量蛋白質(zhì)的分離需求。

● 蛋白電荷或特殊結(jié)構(gòu)如氨基酸側(cè)鏈的特殊排列方式，電泳時存在遷移過快或過慢的現(xiàn)象。

3、蛋白marker的問題
和非預(yù)染marker相比，預(yù)染marker雖然使用更加方便，但是由于偶聯(lián)了染料，也存在分子量偏移的現(xiàn)象，并且同一個marker在不同的電泳體系中，遷移速度也會有所偏差。

abs923預(yù)染蛋白Marker(10-245kDa)

4、樣本制備問題
● 膜蛋白95度加熱變性會引起聚集，導(dǎo)致檢測條帶表觀分子量增大；
● 樣本變性或還原不徹底會影響抗原表位暴露，進而影響其遷移速率，樣本制備時一定要保證上樣緩沖液足量、在保質(zhì)期內(nèi)、并且要選對裂解液，看清具體成分；
● 樣本一定要新鮮，有些蛋白極易發(fā)生降解，制備時要注意。

5、排除以上問題，最重要的就是要充分了解自己的樣本是否表達目的蛋白，以及表達豐度如何，并且查詢廠家的驗證圖，了解抗體的特異性如何。

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